Investigation of ischemia-reperfusion effects on ATF3 and GADD45G gene expression in rat kidney tissues using RT-PCR and real-time PCR
İskemi-reperfüzyonun ATF3 ve GADD45G gen ekspresyonları üzerindeki etkilerinin RT-PCR ve real-time PCR teknikleri kullanılarak sıçan böbrek dokularında incelenmesi
- Tez No: 251971
- Danışmanlar: DOÇ. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR, PROF. DR. ZİYA AKÇETİN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Genetik, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2009
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 93
Özet
İskemi, kan damarlarının büzülmesine ya da tıkanmasına bağlı yetersiz kan akışından kaynaklanan doku oksijen yoksunluğu durumudur. Reperfüzyon, kan akışının iskemik dokuya yeniden gelmesidir. İskemik hasar, oksijenden yoksun kalan hücrelerin nekrozundan kaynaklanırken hasardan yüksek oranda reperfüzyon sorumludur, çünkü reperfüzyonun yol açtığı enflamatuar cevap hem bölgesel hasarı artırır hem de sistemik kötüleşmeye neden olur. Böylece, iskemi-reperfüzyon hasarı (IRI) birçok organa zarar verir. IRI'nin patofizyolojisi karmaşıktır ve enflamatuar mekanizmalar büyük bir rol oynar.İskemik önkoşullama (IP) ve ısı önkoşullaması (HP) IRI'yi azaltmanın iki yöntemidir ve bir organı IRI'ye dayanıklı hale getirmek için iskemi-reperfüzyon durumundan önce uygulanabilir. Aktive edici transkripsiyon faktörü 3 (Atf3) ile büyümenin tutuklanması ve DNA hasarı ile indüklenen gama (Gadd45g), iskemi-reperfüzyon gibi çeşitli stres koşulları tarafından indüklendiği gösterilmiş olan iki gendir. Daha önce yapılmış olan bir mikroarray analiz çalışmasında, sıçan böbrek dokularında, iskemi-reperfüzyon, ısı önkoşullamasını takiben iskemi-reperfüzyon ve iskemik önkoşullamayı takiben iskemi-reperfüzyon koşullarında gen ekspresyonu çalışıldığında Atf3 ve Gadd45g genlerinin anlatımının arttığı gözlenmiştir. Bu çalışmada, bu genlerin aynı koşullar altındaki anlatım seviyeleri, sıçan böbrek dokularından elde edilmiş olan total RNA örnekleri üzerinde RT-PCR ve Real-Time RT-PCR teknikleri kullanılarak çalışılmıştır.Her iki teknikte de, reaksiyon karışımları, aynı reaksiyon tüpünde internal kontrol genin (ß-Aktin) primerleri kullanılarak multipleks örnekler olarak hazırlandı. RT-PCR çalışmalarında, 560C'de 30 saniye primer bağlanma koşulu ve 32 döngülük PCR amplifikasyonu, hem Atf3 hem de Gadd45g'nin multipleks reaksiyonları için en uygun koşullar olarak belirlendi. Multiplex RT-PCR'ın cDNA ürünleri agaroz jele yüklendi ve rölatif gen ekspresyonu miktarı, BioCapt yazılımı ile elde edilen bant hacimleri kullanılarak hesaplandı. Multiplex Real-Time PCR çalışmalarında, elde edilen cDNA'ların CT değerleri belirlendi ve 2-??Ct yöntemi kullanılarak rölatif gen ekspresyonu miktarı hesaplandı. Farklı koşullar uygulanan örneklerin rölatif gen ekspresyonu miktar tayini, Sham kontrol örneklerine göre belirlendi.Her iki tekniğin sonuçları, daha önce elde edilmiş olan mikroarray sonuçlarıyla karşılaştırılmıştır. Elde edilen sonuçlar, mikroarray verileriyle uyumlu şekilde, farklı koşullar altında anlamlı ekspresyon değişimleri olduğunu göstermiştir. Hem Atf3 hem de Gadd45g genleri için en fazla gen ekspresyonu artışı IP uygulanan örneklerde, özellikle de 60 dakikalık reperfüzyon örneğinde görülmüştür. Bu örnekler için Atf3, Gadd45g'den daha yüksek ekspresyon değerleri göstermiştir.
Özet (Çeviri)
Ischemia is a state of tissue oxygen deprivation because of inadequate blood supply owing to constriction of the blood vessels or to obstruction. Reperfusion is the restoration of blood flow to the ischemic tissue. Whereas ischemic injury is mainly due to oxygen-deprived cellular necrosis, reperfusion is highly responsible from the injury because it produces an inflammatory response that both heightens local damage and leads to systemic insult. Thus, ischemia-reperfusion injury (IRI) causes damage in several organs. Pathophysiology of the IRI is complex and inflammatory mechanisms play a major role.Ischemic preconditioning (IP) and heat preconditioning (HP) are two methods of minimizing IRI that can be applied to an organ before an ischemia-reperfusion condition to make the organ tolerant to IRI. Activating transcription factor 3 (Atf3) and growth arrest- and DNA damage-inducible gamma (Gadd45g) are two genes that have been shown to be induced by several stress conditions such as ischemia-reperfusion. In a previous study with microarray analysis, it was observed that Atf3 and Gadd45g genes were upregulated when rat kidney tissues were studied for gene expression upon ischemia-reperfusion, ischemia-reperfusion with heat preconditioning and with ischemic preconditioning. In this study, expression levels of these genes upon the same conditions were investigated in total RNA samples from rat kidney tissues by using RT-PCR and Real-Time RT-PCR techniques.In both techniques, reaction mixtures were prepared as multiplex samples by using the internal control gene (ß-Actin) primers in the same reaction tube. In RT-PCR experiments, the annealing condition of 560C for 30 s and 32 cycles of PCR amplification were determined as optimum conditions for the multiplex reactions of both the Atf3 and Gadd45g genes. cDNA products of the multiplex RT-PCR were loaded to agarose gel, and relative quantification of gene expression was done using the band volumes obtained by the BioCapt software. In multiplex Real-Time PCR experiments, CT values of the obtained cDNAs were determined, and relative quantification of gene expression was done by using the 2-??Ct method. Relative quantification of the treated samples were determined according to Sham control samples.The resulting values of both techniques were compared with the previously obtained microarray results. Results obtained have shown significant expression changes under different conditions and were compatible with the microarray data. For both Atf3 and Gadd45g genes, the highest increase in gene expression level was observed in the IP-conditioned samples and especially in the sample with 60 min reperfusion time. For these samples, Atf3 showed higher expression values than Gadd45g.
Benzer Tezler
- Investigation of ischemia-reperfusion effects on DUSP1 and CXCL2 gene expression in rat kidney tissues using rt-PCR and real-time q-PCR
Rt-PCR ve gerçek zamanlı PCR kullanılarak sıçan böbrek dokularında DUSP1 ve CXCL2 genleri üzerindeki iskemi reperfüzyon etkilerinin incelenmesi
ŞEYMA HANDE TEKARSLAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2009
Moleküler Tıpİstanbul Teknik Üniversitesiİleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
PROF. DR. ZİYA AKÇETİN
- Deneysel alt ekstremite iskemi reperfüzyon modelinde aposinin'in iskelet kası üzerine koruyucu etkilerinin araştırılması
The investigation of apocynin's protective effects on skeletal muscle of experimental lower extremity ischemia-reperfusion model
MEHMET ÖZER
Tıpta Uzmanlık
İngilizce
2015
Göğüs Kalp ve Damar CerrahisiFırat ÜniversitesiKalp ve Damar Cerrahisi Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. AYHAN UYSAL
- Sıçan testisinde oluşturulan deneysel iskemi/reperfüzyon hasarında quersetin etkisinin araştırılması
Investigation of the effect of quesetin in experimental ischemia-reperfusion injury caused in rat testicle
RABİA GEZER
- Karaciğer iskemi-reperfüzyon hasarında silymarin ve redükte glutatyonun koruyucu etkisinin araştırılması
The investigation of protective effects of silymarin and reduced glutathione in hepatic ischemia-reperfusion injury
DILARA ALIYEVA
Doktora
Türkçe
2017
BiyokimyaOndokuz Mayıs ÜniversitesiTıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. RAMAZAN AMANVERMEZ
- Ratlarda bilateral ana karotid arter oklüzyonu ile oluşturulan serebral iskemi ve reperfüzyon modelinde karvakrolün nöroprotektif etkilerinin araştırılması
The investigation of carvaculatory neuroprotective effects in the cerebral ischemia and reperfusion model concerned with bilateral common carotid artery occlusion in the rats
MUSTAFA BAŞARAN
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2017
Nöroşirürjiİnönü ÜniversitesiBeyin-Sinir ve Omurilik Cerrahisi Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ARİF ÖNDER