Construction of pre-enriched metagenomic libraries for isolating novel hydrolase enzymes for liquid/supercritical CO2
Sıvı/superkritik CO2 ortamına uygun yeni hidrolaz enzimlerinin izolasyonu için ön-zenginleştirme uygulanmış metagenomik kütüphane kurulması
- Tez No: 310458
- Danışmanlar: DOÇ. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2011
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 72
Özet
CO2 normal şartlarda gaz halindedir ve basınç yükseldikçe sıvılaşır (LCO2). Sıcaklık ve basınç kritik noktayı geçtiği zaman ise superkritik CO2 (SCCO2) edilir. LCO2/SCCO2 uygulaması endüstriyel olarak temizleme işlemlerinde ve gıdalarda koruma amaçlı kullanılmaktadır. Toksik olmaması ve temizleme işlemlerinde kullanılan zararlı kimyasalların yerine kullanılabilmesi LCO2/SCCO2'in avantajlarındandır. Fakat LCO2/SCCO2 hidrofilik maddelere karşı etkinliği tatmin edici boyutta değildir. Bu sistemin etkinliğinin arttırılabilmesi için lipaz ve proteaz gibi hidrolaz enzimleri ile zenginleştirilmesi gerekmektedir. LCO2/SCCO2 sisteminin biyolojik olarak ekstrem bir ortam olması sebebiyle kullanılacak enzimlerin düşük pH'da ve düşük su içeriği olan ortamda çalışabilmeleri gerekmektedir. Bu tip enzimler asidofilik (düşük pH) ve halofilik (yüksek tuz konsantrasyonuna bağlı olarak düşük su içeriği) mikroorganizmalardan metagenomiks yaklaşımı ile izole edilebilir. Metagenomiks belirli bir çevrede bulunan mikrobiyal populasyonun toplam genom analizi olarak tanımlanmaktadır. Yeryüzündeki mikroorganizmaların çok büyük bir bölümü henüz kültüre edilememektedir ve metagenomiks kültür tekniklerine bağlı kalmadan bu mikroorganizmaların genomu üzerinde çalışılabilmeyi sağlamaktadır. Bu şekilde, kültüre edilemeyen mikroorganizmalardan endüstriyel açıdan önemli bir çok ürün elde edilebilmiştir.Bu çalışmada, ekstrem asit maden sahalarından örnekler toplanmıştır. Bu örneklerden direk genomik DNA eldesi yapılmaya çalışılmış fakat yüksek kalitede DNA elde edilememesi sebebiyle örnekler zenginleştirme kültürüne (0.1 g NH4Cl, 3 g KH2PO4, 0.1 g MgCl2x6H2O, 0.14 g CaCl2x2H2O, 10 g sülfür, 1 lt, pH 4.2) inoküle edilmiştir. Bu zenginleştirme kültüründe gelişen flora 16S rDNA PCR yöntemi ile belirlenmiş ve florada Acidithiobacillus, Sulfobacillus ve kültüre edilememiş bakterilerin baskın olduğu görülmüştür. Zenginleştirme kültürlerinde kültüre edilememiş bakterilerin de bulunması bu kültürün henüz tanımlanmamış ya da keşfedilmemiş genetik materyaller için bir kaynak olabileceğini göstermiştir. Bunu göz önünde bulundurarak, zenginleştirme kültüründen fosmid kütüphanesi kurulmuş ve oluşturulan kütüphane lipaz ve proteaz enzimleri için taranmıştır. İlk olarak, elde edilen yüksek kalitede genomik DNA fosmid adı verilen yüksek kapasiteli DNA vektörlerine aktarılmıştır. Ligasyon ürünü faj ekstraktları aracılığı ile faja dirençli Escherichia coli hücrelerine aktarılmış ve yaklaşık 12,000 klon içeren bir kütüphane oluşturulmuştur. 12,000 birey 21 kb'dan büyük bir genom fragmenti taşımaktadır ve kütüphanenin 252 Mbp'den büyük bir genetik bilgiyi içermektedir. Proteaz ve lipaz enzimlerinin taranması için sırası ile yağsız süt tozu ve tributirin içeren LB agar besiyerleri kullanılmıştır. Kolonilerin hiçbiri proteaz aktivitesi göstermezken, taranan kolonilerden üç tanesi agar besiyeri üzerinde lipolitik aktivite göstermiştir. İleriki çalışmalarla bu potansiyel lipaz enzimlerini kodlayan genler karakterize edilecektir.
Özet (Çeviri)
Liquid CO2 (LCO2) is obtained when pressure is increased. When both temperature and pressure exceed the critical point supercritical CO2 (SCCO2) is formed. LCO2/ SCCO2 is used in industrial cleaning and in food preservation applications. It is advantageous because it is not toxic and can replace many hazardous chemicals used in cleaning application. However, LCO2/ SCCO2 is not so effective against hydrophilic dirt. To increase the efficiency of LCO2/ SCCO2, it can be supplemented with hydrolase enzymes such as lipase and protease. Due to the extreme nature of LCO2/ SCCO2 such as low pH level and no water content, enzymes to be applied in this system should be active at low pH and in non-aqueous medium. Hydrolase enzymes with such extreme properties can be isolated from acidophiles (low pH) and halophiles (low available water due to high salt content) by metagenomic approach. Metagenomics is defined as the total genome analysis of microbial population present in an environment. A high percentage of microorganisms on earth have not been cultured yet and metagenomics make analysis of those microorganisms possible without any dependence on culturing techniques.Therefore, various novel biotechnologically important products from uncultivable organisms have been isolated by this approach.In this study, environmental sediment samples were collected from extreme acid mine drainage (AMD) environments. Those samples were subjected to direct DNA isolation, but high quality DNA could not be obtained. To overcome this problem, samples were enriched in an elemental sulfur containing medium (0.1 g of NH4Cl, 3 g of KH2PO4, 0.1 g of MgCl2x6H2O, 0.14 g of CaCl2x2H2O, 10 g of UV sterilized sulfur per liter, pH 4.2). Microbial flora enriched in this culture was determined by 16S rDNA PCR method. It was found that flora was dominated by Acidithiobacillus, Sulfobacillus and uncultered microorganisms. Presence of uncultured bacterium in enrichment culture indicates that this culture may serve as a source for genetic material which have not been discovered or defined yet. Considering this, the enrichment culture was used to construct a fosmid library to screen for lipase and protease enzymes. Firstly, genomic DNA was isolated and ligated into high capacity DNA vectors called fosmids. Ligation products were transferred to phage resistant Escherichia coli cells by phage particles and a library that is composed of about 12,000 clones was constructed. 12,000 individuals, each carrying a genome fragment of bigger than 21 kb; generated a library containing microbial genetic information more than 252 Mbp. Screening for protease and lipase enzymes were conducted using skim milk and tributyrin LB agar plates, respectively. Unfortunately, none of the clones showed protease activity but three of the screened clones showed lypolytic acitivity on agar plate. Further studies will be carried out to characterize these fosmid clones carrying potential lipase coding genes.
Benzer Tezler
- Self-empowerment through the lenses of pre-service teachers in the era of social complexity
Sosyal karmaşa çağında öğretmen adaylarının merceğinden kendini güçlendirme
SEDA OKUR
Doktora
İngilizce
2024
Eğitim ve ÖğretimOrta Doğu Teknik ÜniversitesiEğitim Bilimleri Ana Bilim Dalı
PROF. DR. HANİFE AKAR
- The nature of pre-service science teachers' argumentation in inquiry-oriented laboratory context
Fen bilgisi öğretmen adaylarının araştırmacı sorgulamacı laboratuar ortamında yaptıkları bilimsel tartışmanın doğası
YASEMİN ÖZDEM
Yüksek Lisans
İngilizce
2009
Eğitim ve ÖğretimOrta Doğu Teknik Üniversitesiİlköğretim Bölümü
PROF. DR. HAMİDE ERTEPINAR
DOÇ. DR. JALE ÇAKIROĞLU
- Dinamik geometri yazılımı ile zenginleştirilmiş ortamlarda öğretmen adaylarının muhakeme süreçleri üzerine bir öğretim deneyi
A teaching experiment on pre-service teachers' reasoning processes in environments enriched with dynamic geometry software
AYŞENUR SIR
Doktora
Türkçe
2022
MatematikBursa Uludağ ÜniversitesiMatematik ve Fen Bilimleri Eğitimi Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MENEKŞE SEDEN TAPAN BROUTIN
- Fen öğretiminde analoji kullanımı: Ders kitaplarındaki analojilerin öğretimde yeniden ele alınması
The use of analogy in science teaching: Reconsideration of the analogies in science textbooks during teaching
MUSTAFA HIDIR
Yüksek Lisans
Türkçe
2018
Eğitim ve ÖğretimZonguldak Bülent Ecevit ÜniversitesiMatematik ve Fen Bilimleri Eğitimi Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. NİLÜFER DİDİŞ KÖRHASAN
- Ayvacık'a bağlı köylerde yöresel konut analizi
Analyses of vernacular houses at the villages of Ayvacik
EVREN KOCABIÇAK
Doktora
Türkçe
2017
MimarlıkYıldız Teknik ÜniversitesiMimarlık Tarihi Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NURAN KARA PİLEHVARİAN