Quantitative analysis of relationships between fluxome and metabolome in Escherichia coli
Başlık çevirisi mevcut değil.
- Tez No: 400765
- Danışmanlar: PROF. DR. J. J. HEIJNEN, DR. W. M. VAN GULIK
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2010
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Technısche Unıversıteıt Delft (delft Unıversıty Of Technology)
- Enstitü: Yurtdışı Enstitü
- Ana Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Metabolik reaksiyon ağlarının farklı koşullardaki davranışlarını öngören kinetik modeller herhangi bir ürün yolu ve ona bağlı merkez metabolizması arasındaki ilişkiyi tamamen ve nicel olarak anlamak için esastır. Bu tezde Escherichia coli?de canlı içi (in vivo) kinetik modelleme araçları geliştirmeye odaklanıldı. Enzim seviyelerinin sabit kabul edilebileceği kararlı veya geçici durumlarda flaksom ile metabolom arasındaki ilişkiler incelendi. Ayrıca hücresel sistemleri kavramakta temel olan stokiyometrik ve termodinamik analizler amaçlandı. Kinetik modellerin temel taşlarından birisi de ağ stokiyometrisidir. Stokiyometrik metabolik ağlarda genellikle doğru biyokütle kompozisyonu ve enerji üreten/tüketen süreçlerin kesin stokiyometrisi, örneğin oksidatif fosforilasyonda ATP üretimi verimliliği (P/O oranı) ve büyümebağımlı/ büyüme-bağımsız bakım enerji gereksinimleri (KX ve mATP) eksiktir. 2. Kısım glukozsınırlı yetiştirilen E. coli K12 hücrelerinin biyokütle kompozisyonunun belirlenmesini, minimal ortamda büyütülmüş karbon-sınırlı kemostat için genom ölçekli minimal ağ altkümelerinin türetilmesini ve bu metabolik ağa ait in vivo ATP stokiyometri parametrelerinin tahminini sunar. Bu, örneğin 5. Kısım?da gösterilen geçici büyüme hızının (ATP dengesine dayalı) hesaplanmasında önemli olan Herbert-Pirt ilişkilerinin türetilmesine olanak sağlamıştır. Bir sonraki 3. Kısım?da, stokiyometrik bir metabolik ağın ATP ilişikli enerji özellikleri termodinamik çerçevede incelendi. Fumarik (ökaryotlarda) ve süksinik (prokaryotlarda) dikarboksilik asit üretimleri örnek çalışmalar olarak ele alındı. Sonuçlar ilgili ağın enerji ilişikli kapasitelerini öğrenmede kara kutu analizinin önemini işaret edip, örneğin teorik anaerobik reaksiyonun Gibbs enerji oluşumu maksimal teorik ürün verimlerinin anaerobik olarak uygun olduğunu (üstelik düşük pH(<3)? da) ortaya koydu. Gerekli yüksek hücre dışı toplam asit konsantrasyonu dikkate alındığında, her iki asit için termodinamik uygulanabilir aktif transport mekanizmaları pH 3?de H+ antiport ve pH 7?de H+ simport olarak bulundu. Daha sonraki detaylı ağ analizi enerjinin nerede biyolojik açıdan faydalı tüketilebiceğini, teorik verimlerde tam anaerobik üretimi sağlayacak yeni metabolik mühendislik hedeflerine de işaret ederek gösterdi. Kinetik bir modelin metabolit konsantrasyonları bilgisine ihtiyacı göz önüne alındığında, öncelikle doğru deneysel verileri elde etmenin gerekliliği açıktır. Hücre içi metabolit konsantrasyonları ölçümü hızlı örnekleme, sızıntı yokluğunda anlık metabolik enzim aktivitesini dindirme ve hücre dışı ortamın kaldırılması ile birlikte metabolitlerin yüksek döngü hızları hesaba alınarak bu bileşiklerin özütlenmesini gerektirir. 4. Kısım?da hücre dışı metabolitleri ayırmak için en sık uygulanan yöntem varyasyonları olan dört farklı dindirme protokolü, yani E. coli?de hücresel metabolik aktiviteyi durdurmak için soğuk metanolle dindirme ve müteakip hücre pelletinin yıkanması araştırıldı. Soğuk metanolle dindirme sırasındaki metabolit kaçağı merkez metabolitlerin, amino asitlerin ve adenin nükleotidlerin doğru LC-ESI-ID-MS/MS veya GC-MS ölçümlerinden titiz bir denge yaklaşımı kullanılarak hesaplandı. Sonuç olarak broth örneklerinin kemostattan hızlıca, bu iş için özel tasarlanmış hızlı bir örnekleme cihazı ile çekilip ve anlık durdurulup (< 180 milisaniye), kültür süzüntüsünün doğrudan filtrasyon ile elde edildiği diferansiyel bir yöntem geliştirildi. In vivo enzim kinetiğine dair bilgi edinmek üzere kullanılan genel yöntem uyaran-tepki deneyleridir. 5. Kısım?da glukoz sınırlı yetiştirilen E. coli kültürüne doğrudan biyoreaktörde uygulanan glukoz-puls sırasında akı ve metabolit yanıtının nicel analizi sunuldu. Akı hesabı kütle denge denklemleri ve ATP dengesi tarafından belirlenen alım/sekresyon hızlarına dayandırıldı. Glikoliz, TCA devri, pentoz fosfat yolu, nükleotidler ve amino asitlerden oluşan toplam 37 metabolitin miktarı 4. Kısım?da geliştirilen diferansiyel metod ile hesaplandı. Saniye zaman ölçekli akı hesabı yeni bir yaklaşımla, yani dinamik çözünmüş O2 (DO) kütle dengesi ve ölçülmüş DO düzeyleri ile gerçekleştirilen qO2(t) hesaplanmasına dayandırıldı. 50 saniyelik bir zaman diliminde elde edilen dinamik akı ve metabolit konsantrasyon-zaman eğilimleri birbirine denkti. Mamafih, büyüme hızında ve dolayısıyla protein sentez hızında gözlenen belirgin artış (50 saniye içinde 3-4 kat) değişen amino asit konsantrasyonlarına yansımadı. Bu durum bu kısa zaman dilimi içinde transkriptlerde artış olabileceğini öne sürdü. Büyüme hızı ile fruktozbisfosfat konsantrasyonu ve oksijen alım hızı ile AMP/ATP oranı arasında in vivo ilişkiler tespit edildi. E. coli (glukoz pulslarına) çok hızlı yanıt verdiğinden, çok kısa aralıklarla örnekleme gereklidir. Grubumuz tarafından tasarlanmış BioScope aleti, ek bir avantaj olan biyoreaktör dışında puls verme ve böylece mevcut kültürü bozmadan, çok sayıda puls-tepki deneylerine olanak sağlayarak, bu amacı yerine getirmektedir. 6. Kısım?da E. coli pertürbasyon deneyleri için tasarlanan yeni BioScope II cihazının karakterizasyonu ve uygulaması açıklandı. BioScope kanalı kısaltılarak toplam gözlem süresi ve örnek aralıkları düşürülmüştür (4 ve 2 ml/dakika akış hızları için sırasıyla 0-8 ve 0-40 saniye). Buna ek olarak gaz transferi membran alanı ile sıvı hacmi arasındaki oran artırılarak oksijen transfer karakteristikleri geliştirildi. Tasarlanan BioScope?un performansı, kararlı durumdaki E. coli kemostat kültürüne bağlı BioScope?da ve doğrudan kemostatta benzer yürütülen glukoz pertürbasyon sonuçlarının çok benzer olduğu gösterilerek, açıklandı. Burada her iki sistemde de oksijen sınırlı olmayan koşulların korunması sağlandı. Doğru metabolit miktar hesabı için 4. Kısım?da açıklanan diferansiyel yöntemin uygulanmasıyla elde edilen sonuçlar açıkça E. coli phosphotransferase sisteminin (PTS) hızlı dinamik davranışını gösterdi. BioScope akı ölçümüne izin vermediğinden bir puls deneyi hem biyoreaktörde (akı miktar hesabı için, 5. Kısım) hem de BioScope?da (hızlı metabolit dinamikleri için, 6. Kısım) yapılmalıdır. 7. Kısım?da glukoz-sınırlı kemostatta yetiştirilen E. coli?nin glikolitik (glukoz) ve glikoneojenik (pirüvat, süksinat) substratlara gösterdiği in vivo dinamik tepki her iki platformda da araştırıldı. Saniye ölçekli akı hesabı dinamik kütle denge denklemleri ve redüksiyon derecesi dengesi ile belirlenen alım/sekresyon oranlarına dayandırıldı. Her eklenen farklı substrattan sonra sistem (akı ve metabolitler) yaklaşık 30-40 saniye içinde psödo-kararlı duruma ulaştı ve büyük bir oksijen kapasitesi gözlendi. İlginç olarak her farklı substrat için 40 saniye içinde büyüme oranı kararlı durumdaki 0,13 1/saat değerinden 0,3 1/saat?e ulaştı. Bu durum örneğin ribozomlarda bir kapasite sınırına işaret etti. Farklı pulsları takiben gözlenen dinamik yanıtlar büyük ölçekte reorganizasyon ve esneklik (12-100 kata kadar değişiklik) gösterdi. Bu durumun metabolit seviyelerindeki aşırı değişikliklerin yol açtığı psödo-/yakın-denge reaksiyonlarının kütle eylem oranlarındaki dinamik kaymalar ve akı yönlerinin tersine dönmesiyle uyumlu olduğu gözlendi. In vivo kinetiği hücre içi dinamik metabolit ve akı bilgileriyle basitleştirilmiş bir termodinamik yaklaşıma dayanarak çalışıldı. Daha önce ekmek mayasında gözlendiği gibi (Q-lineer kinetik) burada da çeşitli enzimlerin basit yakın denge kinetiğine sahip olduğu bulundu. 8. Kısım?da yüksek miktarda süksinat üreten E. coli mutantının kararlı ve dinamik durumlarda lokalize pulslara gösterdiği metabolit ve akı yanıtları karşılaştırmalı bir çalışmayla sunuldu. Glyoksilat yoluna ait iki transkripsiyon faktörünün silindiği mutantta bu değişikliklerin bu yolu etkilemediği ancak gelişmiş enerji verimliliğine önemli bir etkisi olduğu gözlendi. Mutant artırılmış süksinat exporter, silinmiş süksinat importer, silinmiş süksinat dehidrojenaz ve bir nokta mutasyonuyla kapasitesi artırılmış PEP karboksilaz olmak üzere kararlı ve dinamik durum davranışlarına açık etkisi olan dört fonksiyonel mutasyona sahipti. Mutant genel olarak çok daha düşük maksimal alım oranları gösterdi ve süksinat sekresyonu başarılı bir şekilde gerçekleştirildi. Süksinat alımı 26 kat azaldı. Ayrıca mutant büyük ölçekte dinamik akı esnekliği gösterdi. Yaban tip ile karşılaştırıldığında piruvat kinazın yön değiştirmesi dahil TCA döngüsünden oksidatif pentoz fosfat yoluna önemli bir değişim oluştu. Ancak ters bir TCA döngüsü ile olası olan süksinat alımında daha fazla esneklik gözlendi. Bu akı değişimleri metabolit düzeylerindeki büyük ve delokalize olmuş değişiklikler ile uyumluydu. Açıkça, süksinat dehidrojenazın silinmesi silinmiş reaksiyona yakın ve uzak metabolit düzeylerinde büyük değişikliklere neden oldu. Yaban tip gibi mutant da pulslarda enerji yükü açısından aşırı homeostatik davranış gösterdi. Buna karşılık, redoks düzeyi NAD+/NADH?de mutantta daha fazla gözlenen büyük değişiklikler oluştu. Bu büyük redoks değişikliği akı yönünün tersine dönmesiyle ilişkilendirilebilir. 9. Kısım?da pertürbasyon deneylerinin farklı bir uygulama alanı olan büyük ölçekli karıştırma problemleri sunuldu. Heterojen koşullara sahip olduğu bilinen büyük ölçekli biyoreaktörlerin çeşitli boyut küçültme çalışmalarında glukoz gradyanlarının DO?da tükenmeye sebep olduğuna atfedilerek hücrelerin glukoz ve DO geçişlerine yanıtı bildirilmiştir. Bu durum E. coli kemostat kültürünün bir BioScope?a bağlandığı iki bölmeli biyoreaktör sistemi ile taklit edildi. Tamamen aerobik ortamda glukoz sınırlı bölgeden glukoz zengin bölgeye geçiş, taşma metabolizmasını çok hızlı (< 2 saniye) tetikledi. Glukoz gradyanı anaerobik şartlar altında gerçekleştirildiğinde yüksek üretim oranlarında birçok karışık-asit-fermantasyon metabolitleri saptandı. Bu çalışma büyük ölçekli biyoreaktörlerde hücrelerin gradyanlara çok kısa süre maruz kaldığında bile olumsuz süreç performansına neden olabilecek fermentatif yan ürünleri salgıladığını gösterdi.
Özet (Çeviri)
Kinetic models, which predict the behaviour of metabolic reaction networks under different conditions, are indispensible to fully and quantitatively understand the relation between a product pathway and connected central metabolism. In this thesis the focus was to develop tools for future in vivo kinetic modeling in Escherichia coli. The relations between fluxome and metabolome at steady-state or transient state but where enzyme levels can be assumed constant are investigated. In addition, we aimed at stoichiometric and thermodynamic analyses that are also fundamental to comprehend the cellular systems. Network stoichiometry is a significant aspect of kinetic models. Stoichiometric metabolic networks usually lack proper biomass composition and the exact stoichiometry of energy generating and consuming processes, e.g. the efficiency of ATP generation in oxidative phosphorylation (P/O ratio) and growth dependent and growth independent maintenance energy requirements (i.e. KX and mATP). Chapter 2 presents the determination of biomass composition of glucose-limited grown E. coli K12 cells, derivation of minimal network subsets from the genome-scale reconstruction for carbon-limited chemostat cultivations on minimal media and the estimation of the in vivo ATP stoichiometry parameters of this metabolic network. This allowed deriving Herbert-Pirt relations, which are of value, e.g. for quantification of transient growth rate (based on ATP balance), as was shown in Chapter 5. Following in Chapter 3, the ATP related energy aspects of a stoichiometric metabolic network was studied within a thermodynamic framework. Case studies were production of dicarboxylic acids; fumaric (in eukaryotes) and succinic (in prokaryotes). Results point out the importance of black box analysis in learning the energy-related capabilities of the network of interest, e.g. Gibbs energy formation of the theoretical anaerobic reaction indicated that the maximal theoretical product yields are anaerobically feasible, also at low pH (< 3). Considering a required high extracellular total acid concentration, thermodynamically feasible active transport mechanisms were found to be H+ antiport at pH 3 and H+ symport at pH 7 for both acids. Subsequent detailed network analysis showed where biologically useful energy could be consumed, leading to novel metabolic engineering targets to enable fully anaerobic production at theoretical yields. Given that a kinetic model needs information on metabolite concentrations, first a proper method is required to get accurate data. Measurement of intracellular metabolite concentrations requires rapid sampling, instantaneous quenching of metabolic enzymes activity with absence of leakage and removal of the extracellular medium as well as extraction of metabolites taking into account the high turnover rate of these compounds. In Chapter 4 different quenching protocols that are variations of the most commonly applied method to remove extracellular metabolites, namely quenching with cold methanol and subsequent washing of the cell pellet, for arresting cellular metabolic activity in E. coli were investigated. From accurate LC-ESI-ID-MS/MS or GC-MS measurements of central metabolites, amino acids and adenine nucleotides, metabolite leakage during cold methanol quenching was quantified using a rigorous balancing approach. Consequently, a differential method, whereby broth samples are rapidly withdrawn from the chemostat with a dedicated rapid sampling device and instantaneously quenched (< 180 ms) and culture filtrate is obtained by direct filtration of broth, was developed. To gain information on in vivo enzyme kinetics, generally stimulus-response experiments are performed. In Chapter 5 a quantitative analysis of flux and metabolite response during a perturbation of a glucose-limited grown E. coli culture with a glucose-pulse directly applied to the bioreactor, is presented. Flux quantification was based on the uptake/secretion rates, which are determined by mass balance equations and ATP balance. Metabolite quantification for 37 metabolites in glycolysis, tricarboxylic acid (TCA) cycle, pentose phosphate pathway (PPP), nucleotides and amino acids was carried out with the proposed differential method (in Chapter 4). A novel approach to resolve fluxes at seconds time scale was based on the calculation of qO2(t) from dynamic dissolved O2 (DO) mass balance and measured DO levels. The obtained dynamic flux and metabolite concentration-time patterns in a time period of 50 s were highly corresponding. However, the observed remarkable increase in the growth rate (3-4 fold within 50 s), and hence protein synthesis rate was not reflected in changed amino acid concentrations. This suggested that the transcripts are increased in this short time frame. In vivo relations between growth rate and fructose-1,6-bisphosphate (FBP) concentration and between oxygen uptake rate and AMP/ATP ratio were found. Since E. coli is shown to respond very quickly (to glucose perturbations), sampling at very short intervals is required. The device BioScope, designed by our group, fulfills this purpose with an additional advantage that pulses are given outside the bioreactor thus without disturbing the running culture and allowing multiple pulse response experiments. Chapter 6 describes the characterization and application of the new BioScope II device, which was redesigned for E. coli perturbation experiments. Therefore the total observation time window as well as the sample intervals was decreased by shortening the BioScope channel, leading to a time window of 0 - 8 and 0 - 40 s for flow rates of 4 and 2 ml/min respectively. Furthermore the oxygen transfer characteristics were improved by increasing the ratio between the membrane area for gas transfer and the liquid volume. The performance of the modified BioScope is demonstrated by showing that the results of glucose perturbations carried out in the BioScope, coupled to a steady-state chemostat culture of E. coli, and results of similar perturbations carried out directly in the chemostat, are very comparable. Hereby it was ensured that oxygen non-limited conditions were maintained in both systems. For proper metabolite quantification we have applied the differential method, which we described in Chapter 4. The obtained results clearly showed the fast dynamic behaviour of the phosphotransferase system (PTS) in E. coli. The BioScope does not allow flux quantification and therefore a pulse experiment should be performed both in the bioreactor (for flux quantification, Chapter 5) and in the BioScope (for fast metabolite dynamics, Chapter 6). In Chapter 7 in vivo dynamic response of E. coli, grown at glucose-limited chemostat, to glycolytic (glucose) and gluconeogenic (pyruvate, succinate) substrates were investigated in both platforms. Time-resolved flux quantification at seconds time scale was based on the uptake/secretion rates, which are determined from dynamic mass balance equations and the degree of reduction balance. After each added different substrate the system (flux and metabolites) achieved pseudo-steady-state in about 30 - 40 s and a huge oxygen uptake capacity of the cells was observed, and interestingly within 40 s the growth rate reached from its steady-state value of 0.13 h-1 to 0.3 h-1 for each different substrate pulse, indicating a capacity limit in e.g. ribosomes. The observed dynamic responses showed massive reorganization and flexibility (up to 12 - 100 fold change) of intracellular fluxes following the different pulses, which matches with the steep changes in metabolite levels leading to dynamic shifts in mass action ratio?s of pseudo-/near-equilibrium reactions and flux inversions. From the dynamic intracellular metabolite and flux information, the in vivo kinetics was studied based on a simplified thermodynamic approach. It was found that several enzymes showed simple nearequilibrium kinetics as found before in baker?s yeast (Q-linear kinetics). In Chapter 8 a comparative study of steady-state and dynamic metabolite and flux responses to localized pulses for succinate overproducing E. coli mutant is presented. In this mutant two transcription factors of glyoxylate pathway are deleted, which did not seem to affect this pathway but there was a significant effect on improved energy efficiency. The mutant had four functional mutations: increased succinate exporter, a deleted succinate importer, deletion of succinate dehydrogenase and a PEP carboxylase with increased capacity due to a point mutation. These mutations have a clear effect on steady-state and dynamic behaviour. In general the mutant showed much lower maximal uptake rates and succinate export was successfully implemented. Succinate import was 26 fold decreased. Also the mutant showed enormous dynamic flux flexibility. Compared to the wild type a considerable shift occurred from TCA cycle to oxidative PPP, including inversion of pyruvate kinase. Even more flexibility was observed on succinate uptake which seems only possible by an inverted TCA cycle. These flux shifts were in agreement with large and delocalized changes in metabolite levels. Clearly succinate dehydrogenase deletion caused large changes in metabolite levels close to and far from the deleted reaction. The mutant as the wild type showed extreme homeostatic behaviour for energy charge in the pulses. In contrast, large changes in redox level NAD+/NADH occurred where the mutant showed even larger changes. This large redox change can be associated to reversal of flux direction. In Chapter 9 a different application area, which is large-scale mixing problems, of perturbation experiments is presented. Large-scale bioreactors are known to have heterogeneous conditions and several scale-down studies have reported the response of cells to glucose and DO gradients, whereby the glucose gradients have been attributed to cause DO depletion. The situation was mimicked with a two-compartment bioreactor system consisting of an E. coli chemostat culture connected to a BioScope. Fully aerobic transition from a glucose-limiting to a glucose-rich region triggered the overflow metabolism very rapidly (< 2 s). When the glucose gradient was created under anaerobic conditions, many other mixed-acid fermentation metabolites were detected with higher production rates. This study demonstrated that secretion of fermentative by-products occurs even from very short exposures of cells to gradients in large-scale bioreactors and this situation might induce unfavorable process performance.
Benzer Tezler
- Spor yöneticisi adaylarının çatışma yönetimi stilleri ile iletişim becerileri arasındaki ilişkinin incelenmesi
The analysis of relationships between conflict management styles and communication skills of candidate sport managers
ÜNSAL ALTINIŞIK
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
SporTrabzon ÜniversitesiBeden Eğitimi ve Spor Öğretmenliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. AKIN ÇELİK
- Okul müdürlerinin otoriter yönetim tarzı ile öğretmenlerin örgütsel adalet ve örgütsel muhalefet algıları arasındaki ilişkilerin analizi
Analysis of the relationships between the authoritarian management style of school principals and teachers perceptions of organizational justice and organizational dissent
AYTAÇ GEDİK
Doktora
Türkçe
2022
Eğitim ve Öğretimİnönü ÜniversitesiEğitim Bilimleri Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MEHMET ÜSTÜNER
- Otantik liderlik, öğretmen yaratıcılığı, yenilikçiliği ve mutluluğu arasındaki ilişkilerin analizi: Bir karma yöntem araştırması
Analysis of the relationships between authentic leadership, teacher creativity, innovativeness and happiness: A mixed methods research
FUNDA ALPANIK
Doktora
Türkçe
2022
Eğitim ve ÖğretimMarmara ÜniversitesiEğitim Bilimleri Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MÜNEVVER ÇETİN
- Okul liderliği, sosyal motivasyon ve sosyal adalet arasındaki ilişkilerin analizi: Karma yöntem araştırması
Analysis of the relationships between school leadership, social motivation and social justice: A mixed method research
ZEHRA BORA
Doktora
Türkçe
2023
Eğitim ve ÖğretimMarmara ÜniversitesiEğitim Bilimleri Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MÜNEVVER ÇETİN
- Öğretmenlerin sınıf yönetimi anlayışı ile öğrencilerin okul bağlılığı, okul direnci ve akademik başarısı arasındaki ilişkilerin analizi
Analysis of the relationships between teachers' classroom management styles and students' school engagement, school resistance and academic achievement
METİN KIRBAÇ
Doktora
Türkçe
2019
Eğitim ve Öğretimİnönü ÜniversitesiEğitim Bilimleri Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ SEVİM ÖZTÜRK