İnsan eritrosit glutatyon s-transferaz pi izoziminin saflaştırılması ve hiperisin ile etkileşiminin incelenmesi
Purification of human erythrocyte glutathione s-transferase pi isozyme and analysis of the interaction with hypericin
- Tez No: 411028
- Danışmanlar: PROF. DR. NACİYE LEYLA AÇAN, ÖĞR. GÖR. GÜLNİHAL KULAKSIZ ERKMEN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyokimya, Biochemistry
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2012
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Hacettepe Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyokimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 93
Özet
Bu çalışmada, Glutatyon S-Transferaz (EC 2.5.1.18, GST) enzimi insan eritrositlerinden Q-Sepharose iyon değiştirici, Sephadex G25 jel filtrasyonu ve S-Hexylglutathione Sepharose 6B afinite kolonları kullanılarak %71 verimle 2550 kez ve 51 Ünite / mg protein özgül aktivite ile saflaştırıldı. Elde edilen GST PBE-94 kolonu kullanılarak kromatofokuslandı ve izoelektrik noktası 4.8 olan asidik GST-pi elde edildi. GST-pi izozimi % 12'lik SDS-PAGE' de tek bir bant olarak gözlemlendi ve alt birim molekül ağırlığı 23,3 kDa olarak hesaplandı.GST-pi için substrat ve inhibitör kinetiği çalışmalarının tamamı 37°C'de ve pH 6.5'de yapıldı. Substrat kinetiği çalışmalarında sabit CDNB (1 mM) - değişken GSH (0.035-1.6 mM), ve sabit GSH (1 mM) - değişken CDNB (0.035-1.6 mM) derişimleri kullanılarak aktivite ölçümleri yapıldı. Elde edilen sonuçlar kullanılarak Michaelis - Menten, Lineweaver ? Burk, Dixon, Eğim ve Kesim noktalarına karşı 1 / [substrat] grafikleri çizildi ve istatiksel hesaplamalar yapılarak GST-pi için Vm, Km değerleri bulundu. Sabit [CDNB] - değişken [GSH]: Vm = 111 ± 7 Ünite / mg protein, Km ise 0.64 ± 0.08 mM; Sabit [GSH] - değişken [CDNB]: Vm = 85 ± 6 Ünite / mg protein, Km = 0.74 ± 0.10 mM olarak hesaplandı.Antidepresan, antiviral ve fotosensitizör bir molekül olan hiperisinin GST-pi'yi doz bağımlı ve iki fazlı olarak inhibe ettiği saptandı. Birinci faz 1.6 ? M hiperisinle %40 inhibe olurken ikinci fazın tümüyle inhibe edilebilmesi için 30 ? M hiperisin derişimine çıkılması gerekti. Kinetik çalışmalar birinci faz inhibisyonun gözlendiği 0.1, 0.2, 0.4 µM hiperisin derişimlerinde yapıldı ve insan eritrosit GST-pi'sinin, hem GSH hem de CDNB ile nonkompetitif inhibisyona girdiği saptandı. Lineweaver - Burk, Dixon, Eğim ve Kesme noktalarına karşı 1 / [substrat] grafiklerinden ve nonlineer regresyon analizlerinden elde edilen değerler birbirleri ile çok uyumlu idi: Ki(GSH) 0.19 ± 0.01 µM ve Ki(CDNB) 0.26 ± 0.03 µM olarak bulundu.
Özet (Çeviri)
In this study, glutathione S-transferase (EC 2.5.1.18, GST) was purified from human erythrocytes using Q-Sepharose ion exchange, Sephadex G25 gel filtration, and S-hexylglutathione Sepharose 6B affinity column chromatographies with a yield of 71 % and a purification fold of 2550. The specific activity of the enzyme was 51 units per milligram of protein. GST was chromatofocused on PBE-94 and a single asidic isozyme peak (GST-pi) was obtained at pH 4.8. GST-pi displayed a single band on 12 % SDS / PAGE with a subunit Mr of 23.3 kDa.All substrate and inhibitory kinetic experiments were established at 37°C and at pH 6.5. Substrate kinetics experiments were performed at fixed CDNB (1 mM) - varied GSH (0.035-1.6 mM) concentrations, and vice versa. The data obtained were used for performing the Michaelis - Menten, Linewaver ? Burk, Dixon and Slope - intercepts versus 1 / substrates plots, and for statistical analysis. When the varied substrate was GSH, Vm and Km were calculated as 111 ± 7 units / mg protein and 0.64 ± 0.08 mM, respectively. On the other hand, when the varied substrate was CDNB a value of 85 ± 6 units / mg protein for Vm and a value of 0.74 ± 0.10 mM for Km were obtained.Hypericin, an antidepressant, antiviral and photosensitizer molecule, inhibited GST-pi in a dose dependent manner. İnhibition was biphasic. The first phase resulted in 40% inhibition with 1.6 ? M hypericin but the second phase required higher concentrations, 30 ? M of hypericin for total inhibition. All kinetic studies were performed with phase I concentrations (0.1, 0.2, 0.4 µM) of hypericin. It was observed that human erythrocyte GST-pi shows noncompetitive type of inhibition with both subtrates (GSH and CDNB). The Ki values obtained from Lineweaver ? Burk, Dixon, secondary plots (Slope vs 1 / S or y-intercept vs 1 / substrate) and from non-lineer regression analysis were in good correlaton: Ki(GSH) 0.19 ± 0.01 µM and Ki(CDNB) 0.26 ± 0.03 µM were found.
Benzer Tezler
- Characterization of human erythroyte GST TI-I and polymorphic distribution in a Turkish population
İnsan eritrositinde GST TI-1 enziminin karakterizasyonu ve Türk populasyonundaki polymorfizmi
AZRA BOZCAARMUTLU
Yüksek Lisans
İngilizce
1997
BiyokimyaOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MESUDE İŞCAN
- Glutatyon S-transferaz (GST) enziminin insan eritrositlerinden saflaştırılması, bazı karbazol türevlerinin enzim aktivitesi üzerine etkilerinin incelenmesi
Purification of glutathione S-transferase (GST) enzyme from human erythrocytes, investigation of the effects of some carbazole derivatives on enzyme activity
FUAT KARTAL
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
BiyokimyaAtatürk ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ÖMER İRFAN KÜFREVİOĞLU
DR. ÖĞR. ÜYESİ MUHAMMET SERHAT ÖZASLAN
- Bazı antibiyotiklerin asetilkolin esteraz ve glutatyon S-transferaz enzim aktiviteleri üzerine in vitro etkilerinin araştırılması
Investigation of the in vitro effects of some antibiotics on acetylcholine esterase and glutathione S-transferase enzyme activities
GURBET ÇELİK
- 1,1,2,2-tetrakis(p-hidroksifenil)etan: İnsan karbonik anhidraz izoenzimleri I ve II, asetilkolinesteraz, bütirilkolinesteraz,glutatyon S-transferaz enzimleri üzerine inhibisyon etkisi ve antioksidan kapasitesinin incelenmesi
1,1,2,2-tetrakis(p-hydroxyphenly)etan: Determination of its inhibition effect on human carbonic anhydrase izoenzymes I and II, acetylcholinesterase, butirlycholinesterase, glutathione S-transferase and its antioxidant capacity
ZEYNEBE BİNGÖL