Purification and Characterization of β-galactosidase from Enterobacter sp. 3TP2A
Enterobacter sp. 3TP2A bakterisinden izole edilen β-galaktosidaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu
- Tez No: 428027
- Danışmanlar: PROF. DR. KEMAL GÜVEN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2016
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Dicle Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 121
Özet
Bu çalışmada, Türkiye'nin Güneydoğu Bölgesi'nde yer alan Batman ilindeki bir akaryakıt istasyonundan izole edilen mezofilik Enterobacter sp. 3TP2A bakterisinin yüksek miktarda mezofilik β-galaktosidaz enzimi ürettiği görülmüştür. Ayrıca, laktozun β- galaktosidaz üretimini önemli ölçüde arttırdığı görülmüş olup bu bulgu, bu enzimin endüke edilebilir bir enzim olduğunu göstermektedir. Enterobacter sp. 3TP2A bakterisinden izole edilen intraselüler β-galaktosidaz saflaştırılıp karakterize edildi. Saflaştırma işlemi %70 amonyum sülfat çöktürmesi, diyaliz, ultrafiltrasyon ve son olarak da Sephadex G-75 kromatografisi yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Enzim, jel geçirgenlik kromatografisi kullanılarak yaklaşık %11 verimle 17.3 kat saflaştırıldı. Saflaştırılan enzimin pH 8.0 ve 35 oC'de stabil olduğu ve moleküler ağırlığının ise SDS-PAGE ve native-PAGE metodlarına göre yaklaşık 60 kDa olduğu tespit edilmiştir. Çeşitli metal iyonların farklı CaCl2, MgCl2, ZnCl2, CuCl2 ve EDTA (1, 2, 5, 10 ve 20 mM) konsantrasyonlardaki etkileri incelenmiştir. EDTA ve Cu2+'nın Enterobacter sp. 3TP2A'dan saflaştırılan β-galaktosidaz üzerinde inhibe edici bir etkiye sahip oldukları belirlenmiştir. EDTA'nın enzim aktivitesini %76'ya kadar inhibe ettiği ve Cu2+'nın β- galaktosidaz üzerindeki inhibe edici etkisinin düşük konsantrasyonlarda bile güçlü olduğu görülmüştür (96.9%). Bununla birlikte, Mg2+'nın saflaştırılan enzimin aktivasyonuna sebep olduğu görülmüştür. Ca2+ ise enzim aktivitesini önemli ölçüde etkilememiş olup 20 mM (yalnızca 16%)'de enzimin deaktivasyonuna sebep olmuştur. Ancak, Zn2+ 1, 2 ve 5 mM'de enzimin aktivasyonuna sebep olmuştur (sırasıyla, %32, %27, %8). Mg2+ konsantrasyonundaki artışın 47%'ye kadar enzim aktivasyonuna sebep olması ve EDTA tarafından inhibe edilmesi, bu enzimin metal-bağımlı veya metaloenzim olduğunu göstermektedir. Buna ilaveten, farklı konsantrasyonlardaki inhibitörlerin saflaştırılan enzim üzerindeki etkileri şu konsantrasyonlarda incelenmiştir: PCMB (0,2, 0,4, 1, 2 mM) , Iodo, DTT, β-mer, N-etil, (1, 2, 4, 8 mM). Enzim, N-etil tarafından tamamen inhibe edilmesine karşın (%100), DTT tarafından etkilenmemiştir. Enzim, β-galaktosidaz aktivitesini 8 mM'de %14 oranında arttıran β-mer tarafından hafifçe etkilenmiştir. Iodo da β-galaktosidaz aktivitesini hafifçe etkilemiştir (%13'e kadar). PCMB ise enzimatik aktiviteyi %87'lere varan inhibisyonla büyük oranlarda etkilemiştir. Lineweaver-Burk grafiği lineer olarak belirlenmiş olup bu sonuç basit bir Michealis-Menten kinetiğine işaret etmektedir. Vmax 0.701 (μmol/ dak mg) ve Km 0.104 mM olarak tespit edilmiştir. Ayrıca, laktoz hidrolizi süresinin, saflaştırılan β-galaktosidaz tarafından katalize edilen reaksiyondan dolayı, 10 saate kadar çıktığı gözlemlenmiştir. Bu çalışmanın amacı Enterobacter sp. 3TP2A'dan mezofilik β-galaktozidaz'ı saflaştırmak, karakterize etmek ve laktoz hidrolizi gibi biyoteknoloji alanında kullanımını test etmekti. Elde edilen bulgular bu enzimin iyi bir aday olabileceğini göstermiştir.
Özet (Çeviri)
In this study, a mesophilic Enterobacter sp. 3TP2A isolated from petroleum station in Batman in the southeast of Turkey was identified and found to produce a high amount of mesophilic β-galactosidase. The lactose was found to increase the β-galactosidase production to a great extent, meaning that this enzyme is inducible. An intracellular β- galactosidase from Enterobacter sp. 3TP2A was purified and characterized. The enzyme was purified by ammonium sulphate precipitation 70%, dialysis, ultrafiltration and finally using Sephadex G-75 chromatography method. The enzyme was purified to 17.3-fold after Gel permeation chromatography with a yield of approximately 11%. The purified enzyme was found to be stable in pH 8.0 and temperature of 35 oC. The Molecular weight of the purified enzyme was found to be about 60 kDa by both SDS-PAGE and native-PAGE. The effects of various metal ions at different concentrations of CaCl2, MgCl2, ZnCl2, CuCl2, and EDTA (1, 2, 5, 10 and 20 mM) were tested. EDTA and Cu2+ had an inhibitory effect on the β-galactosidase purified from Enterobacter sp. 3TP2A. EDTA inhibited the enzyme activity (upto 76%) and Cu2+ had strong inhibitory effect on β- galactosidase even at low concentrations (96.9%). However, Mg2+ caused activation of the purified enzyme. Ca2+ did not effect enzyme activity to a great extent, causing deactivation of the enzyme at 20 mM (only 16%), while Zn2+ at 1, 2 and 5 mM inhibited enzyme activity (32, 27, 8%, respectively). Increase in the concentration of Mg2+ causing activation upto 47% and also inhibition by EDTA show that the enzyme is metal-dependent or a metalloenzyme. Also determining the effect of different concentration of inhibitors on purified enzyme; PCMB (0.2, 0.4,1, 2 mM) , Iodo, DTT, β-mer, N-ethyl, (1, 2, 4, 8 mM). The enzyme was completely inhibited by N-ethyl (100%), but not affected by DTT. The enzyme was slightly affected by β-mer enhancing β-galactosidase activity at 8mM with 14% . The Iodo had a slight effect on β-galactosidase activity (upto 13%). PCMB inhibited the enzymatic activity to a great extent upto approx. 87%. The Lineweaver-Burk plot was linear, suggesting a simple Michealis-Menten kinetics. The Vmax was found as 0.701 (μmol/ min mg) and Km was found as 0.104 mM. It was also found that the time for lactose hydrolysis continues up to 10 h with the reaction catalyzed by purified β-galactosidase. The aim of this study was to purify and characterize the mesophilic β-galactosidase from Enterobacter sp. 3TP2A and then to test for use in biotechnology such as lactose hydrolysis. The results obtained indicated that this species may well be a good candidate.
Benzer Tezler
- Termofilik bacillus zhangzhounesis 2ÇM4'ten elde edilen β- Galaktosidazın saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of β-Galactosidase from Thermophilic bacillus zhangzhounesis 2ÇM4
CEMAL DİRİ
Yüksek Lisans
Türkçe
2023
BiyokimyaDicle ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. FATMA MATPAN BEKLER
- Kurutulmuş nohut granüllerinden (Cicer arietinum) β-galaktosidaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of β-galactosidase enzyme from dry chick pea granules (Cicer arietinum)
ERDEM KAYA
- Kefir danesinden izole edilen Kluyveromyces marxianus'dan üretilen β-galaktosidaz enziminin kısmi saflaştırılması ve karakterizasyonu
Partial purification and characterization of β-galactosidase enzyme produced by Kluyveromyces marxianus isolated from kefir grains
SEDA ÖZARSLAN
Doktora
Türkçe
2018
Gıda MühendisliğiSüleyman Demirel ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. TUĞBA KÖK TAŞ
- Çermik kaplıcalarından izole edilen termofilik Geobacillus vulcani 2Çx'te beta-galaktosidaz enzim karakterizasyonu
Characterization of beta-galactosidase enzyme from thermophilic geobacillus vulcani 2Çx in Çermik hot spring
NAZLI POLAT
Yüksek Lisans
Türkçe
2021
BiyolojiDicle ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. KEMAL GÜVEN
- Bazı toprak bakterilerinin transglutaminaz, levansukraz ve beta galaktozidaz üretim yeteneklerinin taranması ve elde edilen enzimin kısmi karakterizasyonu
Sacanning the transglutaminase, levansucrase and beta galactosidase production of some soil bacteria and partial characterization of enzymes
ELİF GÜLŞEN KARABACAK
Yüksek Lisans
Türkçe
2021
Gıda MühendisliğiOndokuz Mayıs ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AHMET HİLMİ ÇON