Geri Dön

Investigation of novel genes in autosomal dominant Behçet syndrome

Otozomal dominant Behçet sendromunda özgün genlerin araştırılması

PDF İndir

  1. Tez No: 562019
  2. Yazar: GAMZE TURAN
  3. Danışmanlar: PROF. DR. EDA TAHİR TURANLI
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Genetik, Genetics
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2019
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 79

Özet

Behçet sendromu (BS) üveit, deri lezyonları, ağız ve genital bölgelerdeki aftlar ile ayırt edilen oküler, nörolojik, gastrointestinal gibi birçok doku ve organ sisteminde tutuluma neden olan multisistemik inflamatuar bir hastalıktır. Hastalık ilk olarak, 1937 yılında Prof. Dr. Hulusi Behçet tarafından tanımlanmıştır. BS genellikle 20-30'lu yaşlarda ortaya çıkmaktadır. Orta doğudan Akdeniz ülkelerine kadar uzanan ve İpek Yolu olarak adlandırılan bölgede sık olarak görülen bir hastalıktır. Özellikle Türkiye, 37/10.000'lik oranla en yüksek görülme sıklığına sahiptir. Türkiye'yi 1,7/10.000 oranıyla Irak, 1,6/10.000 oranıyla İran, 1,4/10.000 oranıyla Çin, 1/10.000 oranıyla da Japonya takip etmektedir. Hastalığın etiyolojisi kesin olarak bilinmemekle birlikte, çevresel ve genetik faktörlerin BS oluşumunda etkili olduğu düşünülmektedir. Özellikle,“İpek Yolu”üzerinde artan prevalansa sahip olması; Türk (18,2), Kore (15,4) ve Yahudi (13,2) populasyonlarındaki ailesel birikimi gösteren çalışmalar ve Türkiye'deki BS'li bireyin kardeşlerinde hastalığın tekrar riskinin arttığını (11.4-52.5) gösteren çalışmalar genetik faktörlerin BS oluşumunda etkili olduğu göstermektedir. Bunlara ek olarak, BS ile en çok ilişkilendirilen HLA-B geninin alt allellerinden biri olan HLA-B51 allelidir. HLA-B genindne üretilen ürünler, CD8+ T hücrelerine antijen sunumunda görevlidir. HLA-B51 alelinin dünya üzerindeki dağılımı, Behçet sendromunun dünya üzerindeki dağılımıyla paralellik göstermektedir. Ancak HLA-B51 alleli taşıyan sağlıklı bireylerin olması ve HLA-B51 alleli taşımayan BS'li bireylerin olması, hastalığın oluşumunda başka potensiyel etkilerin görev aldığı düşünülmektedir. Alerjenlere mazruz kalma, diyet, çevresel toksikler, güneş ışığı, enfeksiyonel maddeler gibi çevresel etkenlerin de, yatkın gentipli bireylerde erken immune sistemin uyarılmasına neden olabilir. Bu çalışmada, BS tanısı alan dört bireyin olduğu bir Türk ailesi ile çalışılmıştır. BS'li bireylerin tanısı İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Romatoloji Polikliniği'nde konulmuştur. Etkilenen tüm bireyler BS için Uluslararası Çalışma Grubu kriterlerine uymaktadır. Ailedeki tüm hastalarda, 16 yaşından önce hastalık teşhis edilmiştir. Oral/genital ülserler ve ostiofolliculitis tanıları tüm hastalar tarafından paylaşıldığı, Proband'ın ayrıca üveit ve derin ven trombozu tanıları varken, ailedeki diğer hasta bireylerin tekrarlayan artrit tanısı bulunmaktadır. Ailedeki tüm bireyler çalışmamıza katılmayı kabul etmiştir ve etik kurulundan çalışma için onay alınmıştır (Referans no: MBG.22/2014). Üzerinde çalışılan ailenin kalıtım modeline bakılarak belirlenen, bu ailede otozomal dominant Behçet sendromuna neden olabilecek veya otozomal dominant Behçet sendromuyla ilişkilendirilebilecek olası aday gen veya genlerin belirlenmesi amaçlanmıştır. Ailedeki sağlıklı anne, BS'li baba ve BS'li üç evlattan alınan kan örnekleri topladı. Bu kan örnelerinden periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC) genomik DNA izolasyonları yapılmış ve genomlarındaki fonksiyonel bölgelerin (ekzon ve splicing bölgelerinin) incelenmesi için ekzom dizilemeleri gerçekleştirilmiştir. Ekzom dizilemesi sonucunda, ailedeki tüm bireylerin ekzom datasında yaklaşık 140.000 varyant bulunmaktadır. Ailedeki tüm BS'li bireylerde bulunan ortak varyantları bulmak için ekzom dataları Galaxy.org kullanılarak çakıştırıldı. Ortak olarak bulunan varyantlardan sağlıklı annede bulunan varyantlar elendi, böylelikle sadece BS'li bireylerfe paylaşılan varyantlar belirlendi. Bu varyantlar wANNOVAR programı ile anote edildi, böylelikle elimizde bulunan varyantlara dair bilgiler birçok veritabanında çekilip bir excel dosyasında toplanmış oldu. Excel dosyası hastalıkla ilişkilendirilebilek herhangi bir varyant/lar tespit etmek için filtelendi. Hastalık kalıtım modeli otozomal dominant olarak belirlendiği için; otozomal kromozomlarda bulunan nadir, ekzonik/splicing, heterozigot varyantlara bakıldı. Bu aday varyantları içeren genler veritabanlarında immüne sistem ve inflamatuar cevap oluşturma ile ilişkilendirilecek özellikleri (bulundukları yolaklara, ilişkilendirildikleri fenotiplere, evrimsel korunurluğa, ekspresyon seviyeleri, farklı genlerle olan ilişkilerine, knock-out hayvan modellerine) araştırılmıştır. Bununla birlikte, in silico tahmin araçlarının (SIFT, Polyphen2, Mutationtaster) varyant değişimini nasıl değerlendirdiğine dikkat edilmiştir. Böylece altı farklı gendeki altı varyant potansiyel aday olarak belirlenmiştir. Bu varyantların genotipleri ailedeki diğer iki evlatta (biri sağlıklı, biri teşhis konulmamış) Sanger dizilemesiyle kontrol edilmiştir. Bu belirlenen varyantlardan üçü, sağlıklı evlatta bulunmasından dolayı elenmiştir. Olası adaylar; IL-1RAP genindeki c.T11G; p.L4R, NAGK genindeki c.A35T; p.D12V ve SLC9A2 genindeki c.C1490G; p.A497G variantları olarak belirlenmiştir. Kalan varyantların varlığı, 115 sağlıklı kontrolun kan örneklerinden elde edilen genomik DNA'ları kullanılarak High resolution melting (HRM) yöntemi ile kontrol edilmiştir. Bu nedenle tüm sağlıklı kontrollerin DNA örneklerinin konsantrasyonu 5-10 µl/µg aralığına dilüe edilmiştir ve her kuyuya eşit miktarda yüklenmiştir. Her örnek duplike olarak çalışılmıştır. Sağlıklı kontrollerin erime eğrileri, referans olarak belirlenen sağlıklı anne (homozigot vahşi tip) ve hasta babanın (heterozigot) erime eğrileri ile karşılaştırılarak; sağlıklı kontrollerin IL-1RAP genindeki c.T11G; p.L4R, NAGK genindeki c.A35T; p.D12V ve SLC9A2 genindeki c.C1490G; p.A497G variantları için genotiplerine karar verilmiştir. Karşılaştırma sırasında varyantın durumundan şüphelenilen bireyler Sanger dizileme ile kontrol edilip, teyit edilmiştir. HRM sonucunda 115 üç aday varyant da tespit edilmemiştir ve adaylıklarını korumuşlardır. Son üç olası aday içinden IL-1RAP, gen ürününün dahil olduğu IL-1 sinyal iletim yolağı ve bu yolağın inflamatuar cevap oluşturmadaki öneminden dolayı en güçlü aday olarak görülmüştür. IL-1RAP'ın iki izoforma sahiptir; bu izoformlardan biri membrana bağlı olarak bulunan transmembran formdur, bu form sahip olduğu sitoplazmik domainden dolayı IL-1 sitokin ailesinin üyelerinin sinyal iletimini IL-1 reseptör 1 (IL-1R1) ile etkileşime girerek gerçekleştirebilmektedir. Ayrıca, transmembrane form bir diğer IL-1 reseptör 2 (IL-1R2) ile de etkileşmektedir ancak IL-1R2 sitoplazmik domaine sahip olamadığı için IL-1 sinyal yolaklarını aktivleştiremez, bu nedenle IL-1 sitokin ailesinin üyelerinin inhibasyonuna neden olur. Bir diğer IL-1RAP izoformu ise hücre dışı ortamda çözünmüş olarak bulunan çözünür formudur. Alternatif kırpılma ile oluşan bu form çözünür ve transmembran formdaki tüm IL-1 reseptörleri ile etkileşir ancak sitoplazmik domaine sahip olmadığı için IL-1 sitokinlerinin IL-1 reseptörlerince tutulup sinyal yolaklarının aktifleşmesini engeller. Ayrıca çözünür formadaki IL-1R2 ile oluşturduğu kompleks, IL-1β'ı yüksek afinite ile tutup başka reseptörlere bağlanmasını engelleyerek IL-1β'nın hücre dışı ortamda nötralizasyonunun ana mekanizması olduğu düşünülmektedir. Özellikle, IL-1RAP'ın IL-1β aktivayson ve inhibasyonundaki görevi göz önüne alınarak; IL-1β seviyeleri bir BS'li bireyden ve dört sağlıklı kontrolde Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) yöntemi kullanılarak karşılaştırılmıştır. Bunun için; ataklı dönemde BS'li bireyden ve dört sağlıklı kontrolden alınan kan örneklerinden periferik kan mononükleer hücre izolasyonu yapılmış ve bu hücrelerden tüm protein izlasyonu yapılmıştır. ELISA için optimum protein konsantrasyonunu belirlemek için seri dilüsyon gerçekleştirilmiş ve son protein konsantrasyonu 4000 pg/ml olarak belirlenmiştır, BS'li birey ve dört sağlıklı kontrollerin protein konsantrasyonları buna göre ayarlanmştır. ELISA sonucunda; BS'li bireyde IL-1β seviyesi 150.5 µg/ml ve sağlıklı kontrollerde ise 165.4 ± 30.4 µg/ml çıkmıştır. Ataklı dönemdeki BS'li bireyde daha yüksek seviyede beklenen IL-1β seviyesi, sağlıklı kontrollerdeki IL-1β seviyesine yakın seyrettiği görülmüştür. Bu nedenle, tanımladığımız c.T11G; p.L4R varyantının IL-1RAP üzerindeki etkisinin, IL-1β inhibasyon mekanizmasında bozulmaya neden olabileceği fikrini ortaya çıkarmıştır.

Özet (Çeviri)

Behçet syndrome (BS) is a multisystemic inflammatory disease which is characterized by recurrent oral and genital ulcers, ocular lesions, skin manifestations, and arthritis, as well as vascular, neurological, and intestinal involvement. The disease usually occurs in 20-30 years of age. It is commonly seen in the Silk Road region which extends from the Middle East to the Mediterranean basin. In particular, Turkey has the highest incidence with 37/10.000 ratios. Although the etiology of the disease is still uncertain, environmental and genetic factors are thought to be effective in the pathogenesis of BS. Especially, increased disease prevalence throughout the Silk Road and familial aggregation of BS in Turks (18.2%), Koreans (15.4%), Jews (13.2%), and the high sibling recurrence risk in Turkey support genetic factors in BS pathogenesis. In addition, the distribution of the HLA-B51 allele, which is one of the subtypes alleles of the HLA-B gene and the most associated allele with BS, shows parallelism with the distribution of Behçet's syndrome around the world. However, the presence of healthy individuals with HLA-B51 allele and the presence of BS patients without HLA-B51 allele showed that BS could have other potential factors in the its pathogenesis. In this thesis, we present a Turkish family diagnosed with BS involving a father and three of the five children. The diagnosis of individuals with BS was established at the Istanbul University-Cerrahpaşa Medical Faculty, Outpatient Clinic of Rheumatology. The patients in the family agreed to participate in the study and the ethics committee approval was obtained (reference no: MBG.22/2014). This study is aimed to investigate candidate gene/s which is/are associated with autosomal dominant BS in this family. Genomic DNA was isolated from the blood samples taken from the unaffected mother, the father with BS, and the three children with BS. Genomic DNA samples were used to investigate functional regions in the genome by exome sequencing. As a result of the exome sequencing, the variants shared with all BS patients in the family and non-shared with unaffected mother were found. Among these variants; The first candidate variants were determined according to rare (MAF≤0.005), exonic/splicing, heterozygous variants in autosomal chromosomes. The genes that contain these candidate variants have been investigated in various databases by their association with immune system and/or inflammatory response (pathways, interactions, expression levels, phenotypes, knock-out animal model and evolutionary conservation). The evaluation of variant changes at in-silico prediction tools (SIFT, polyphen2 and Mutationtaster) were taken into consideration. Six variants in six different genes were chosen as potential candidates. These variants were controlled in two siblings (one unaffected, one undiagnosed) by Sanger sequencing. Three of the candidate variants were also detected in unaffected sibling, thus they were eliminated. Potential candidates were identified as c.T11G; p.L4R in IL-1RAP gene, c.A35T; p.D12V in NAGK gene and c.C1490G; p.A497G in SLC9A2 gene. The presence of remaining variants were controlled in 115 healthy controls by High Resolution Melting (HRM) method. None of them were present in the healthy controls. We suggested that among the three candidate genes, the most relevant gene is IL-1RAP to autosomal dominant BS in this family. Because IL-1RAP functions in the IL-1 signaling pathway which is an essential pathway in forming the inflammation response. Due to its role in activation and inhibition of IL-1β, IL-1β levels both in the BS patient and the four healthy controls were compared by using Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) method. Whole protein isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) gathered from the affected son who is in the attack period and from healthy controls. ELISA results revealed the IL-1β levels as 150.5 µg/ml and 165.4 ± 30.4 µg/ml in the BS patient and the four healthy controls, respectively. Although the IL-1β level of BS patient in the exacerbation period should be higher than the healthy controls, it was observed that their levels were closer than expected. Given these results, we proposed that the possible effect of the identified variant c.T11G (p.L4R) in IL-1RAP may have caused a defect in the inhibition mechanism of IL-1β signal transduction.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    693086

    Investigation of novel recessive causative genes and gene/allele frequency for CMT disease in Turkey

    Çekinik CMT hastalığı için yeni genlerin araştırılması ve Türkiye'de CMT yapıcı gen/alel sıklığı incelemesi

    AYŞE CANDAYAN

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2021

    GenetikBoğaziçi Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ESRA BATTALOĞLU

  2. Tez No

    493288

    Subkortikal enfarkt ve lökoensefalopati ile giden serebral arteriyopati (cadasıl/carasıl) hastalığı ile ilişkili notch3 ve htra1 gen mutasyonlarının araştırılması

    Investigation of the notch3 and htra1 gene mutations in cerebral arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy (cadasil/ carasil)

    BURCU RÜSTEMOĞLU

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2018

    Genetikİstanbul Üniversitesi

    Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEHRA OYA UYGUNER

    DR. GÜVEN TOKSOY

  3. Tez No

    829145

    Investigation of novel genes and functional roles in MEFV negative FMF patients through next-generation sequencing

    MEFV negatif ailesel Akdeniz ateşi hastalarında yeni nesil dizileme yöntemiyle özgün genlerin ve işlevlerinin araştırılması

    MERVE ÖZKILINÇ ÖNEN

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    Genetikİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. EDA TAHİR TURANLI

  4. Tez No

    858383

    Polikistik böbrek hastalığının moleküler yöntemlerle araştırılması

    Investigation of polycystic kidney disease by molecular methods

    ÖZGE SARICA YILMAZ

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    GenetikManisa Celal Bayar Üniversitesi

    Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. NURAY ALTINTAŞ

  5. Tez No

    733269

    Investigation of familial multiple sclerosis genetics

    Ailesel multipl skleroz genetiğinin araştırılması

    ELİF EVEREST

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Genetikİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. EDA TAHİR TURANLI

Geri Dön