Geri Dön

CHARACTERIZATION OF THE REGULATORY MECHANISMS OF NOD LIKE RECEPTORS IN THE GENERATION OF IMMUNE RESPONSES: REVISITING NLRC4 IN EOSINOPHILIC FUNCTIONS IN VITRO

BİR EDİNSEL BAĞIŞIKLIK OLAN T2 HÜCRE CEVABININ NOD BENZERİ RESEPTÖRLERİ (NLR) İLE REGÜLASYON MEKANİZMALARININ KARAKTERİZASYONU

PDF İndir

  1. Tez No: 562496
  2. Yazar: ILGIN AKKAYA
  3. Danışmanlar: DOÇ. DR. CEREN ÇIRACI
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Allerji ve İmmünoloji, Allergy and Immunology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2019
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 83

Özet

Bağışıklık sistemi, vücudu patojenlerden koruyan ve içsel bir düzensizlik durumunda homeostatik dengeyi sağlayan kompleks ve dinamik bir mekanizmalar bütünüdür. Patojenlere karşı savunmadaki rollerinin yanı sıra bağışıklık sistemi, sinir sistemi ve çeşitli metabolik sistemlerle iç içe geçmiştir ve antikor üretiminden dokuların yeniden düzenlenmesine kadar uzanan karmaşık ve çok boyutlu süreçlerden meydana gelmektedir. Bağışıklık sistemi, doğal bağışıklık ve edinsel bağışıklık adı verilen birbiriyle iç içe geçmiş 2 ayrı kategoriye ayrılmıştır. Doğal bağışıklık daha hızlı ve büyük boyutlu bağışıklık yanıtlarından meydana gelirken edinsel bağışıklık patojenlerle etkileşime geçtiğinde (doğal bağışıklık sistemiyle de ilişki içerisinde olarak) bu patojenlere karşı spesifik yanıtlar geliştirir. Buna ek olarak, edinsel bağışıklık daha önce etkileşime geçtiği patojenlere karşı savaşmak üzere hafıza mekanizması geliştirmektedir. Doğal bağışıklık yanıtları çoğunlukla Patern Tanıma Reseptörleri (PRR) adı verilen korunmuş ama sınırlı bir reseptör dizisi tarafından düzenlenir. PRR ailesi, membran bağlı ve sitozolik reseptörler olmak üzere ikiye ayrılır. Toll benzeri reseptörler (TLR) ve C-tipi lektin reseptörleri (CLR) membran bağlı PRR'ler iken NOD benzeri reseptörler (NLR) ve RIG-I benzeri reseptörler (RLR) sitoplazmik reseptörleri meydana getirirler. Bu tez, NLRC4'e ve bu proteinin TLR üzerinden aktivasyonuna dair bilimsel bilgileri daha kapsamlı hale getirmek üzere tasarlanmış deneyleri içermektedir. TLR ailesinin üyeleri, hızlı oluşturulan çok çeşitli enflamatuvar yanıtın geliştirilmesinde önemli rollere sahip hücre zarına bağlı reseptörlerdir. TLR2 mikrobiyal glikolipitleri ve lipopeptitleri tanırken TLR4 lipopolisakkaritleri tanımaktadır. Bir başka yüzey reseptörü olan TLR5 ise bakteri kamçısını tanımaktadır. TLR sinyal yolağının aktifleşmesi, IL-1, IL-6, IL-12, IL-18, ve CD80, CD86 benzeri enflamasyona yol açan sitokinlerin ve reseptörlerin ifade edilmesine yol açmaktadır. Sitoplazmada, herhangi bir zara bağlı olmayan bir şekilde bulunan NLR'ler moleküler paternler ya da hasar molekülleri (DAMP) tarafından uyarılır. İnsanlarda NLR'lerin 22 üyesi bulunmaktadır. NLR'ler 3 ayrı domeynden meydana gelmektedir: Proteinin C terminalinde yer alan ve mikrobiyal molekülleri ya da hasar molekülleri tanıyan LRR domeyni, NLR proteinlerinin oligomerizasyonunu sağlayan merkezi bir NACHT domeyni ve sinyal iletimini aktif hale getiren N terminal domeyni. NLR ailesinin belki de en fazla çalışılmış ve en iyi karakterize edilmiş üyesi olan NLRP3, NLRP alt ailesinin bir üyesidir. NLRP3'ün N terminal domeyni PYRIN molekülünden oluşurken ligandını tanıyarak aktif hale gelen NLRP3'ün inflamazom adı verilen protein komplekslerini oluşturabilmesi için ASC adaptör proteinine ihtiyacı vardır. Diğer yandan, PYRIN domeyni olmayan NLRC4, ASC adaptör proteiniyle etkileşerek ya da etkileşmeksizin inflamazom oluşturabilmektedir. Her iki NLR üyesinin de aktifleştiklerinde inflamazom adı verilen protein komplekslerini oluşturdukları bilinmektedir. Bu aktivasyon, IL-18 ve IL-1β sitokinlerinin aktif formlarına kesilerek hücre dışına salgılanmalarıyla sonuçlanır. Eozinofiller, hücre dışı parazitlere karşı savunmada ve alerjik yanıtların geliştirilmesinde önemli rollere sahiptir. Çok etkili bağışıklık yanıtları geliştirmelerinden ötürü, eozinofiller insan kanındaki akyuvar hücrelerinin yalnızca %1-6'sını meydana getirmektedir. Ve her ne kadar NLRC4 ve NLRP3 proteinleri diğer alanlarda ve akyuvar hücreleri bağlamında yoğun bir şekilde çalışılmış olsalar da bu proteinlerin eozinofilik fonksiyonları nasıl şekillendirdikleri diğer akyuvar hücrelerine göre pek bilinmemektedir. Eozinofiller insan kanında az sayıda oldukları için bu projede insan eozinofilik lösemi hücre hattı ve eozinofilik fonksiyonların çalışılması için iyi bir model olan EoL-1 hücreleri kullanılmıştır. Genel olarak PRR'lerin ve özel olarak da NLR'lerin fonksiyonlarını karakterize edebilmek için öncelikle NLRC4 ve NLRP3'ün ve de eozinofilik belirteçlerin ifadeleri analiz edilmiştir. Eozinofil benzeri EoL-1 hücrelerinin hem mRNA hem de protein seviyelerinde NLRC4 ve NLRP3 ifade ettikleri gözlemlenmiştir. Ayrıca, inflamazom aktifleşmesine yol açan iki sinyal (1. sinyal olarak TLR2 ligandı PAM3CSK4 ve 2. sinyal olarak hücre içine transfekte edilen NLRC4 ligandı bakteri kamçısı) ile uyarılan EoL-1 hücrelerinde NLRC4'ün hem mRNA hem de protein seviyelerinde artış yaşandığı gözlemlenmiştir. Dahası, gerçekleştirilen western blot sonuçları EoL-1 hücrelerinde NLRC4 ve NLRP3 inflamazomlarının aktifleştiğini ve NLRC4 ve NLRP3 ligandlarıyla uyarılan hücrelerde kazpaz-1 ve IL-1β'nın aktif formlarına kesildiğini ortaya koymuştur. ELISA sonuçları, NLRC4 inflamazomunun aktivasyonundan 24 saat sonra, NLRP3 inflamazomunun aktivasyonundan 10 saat sonra EoL-1 hücrelerinin hücre dışına IL-1β salgıladığı ortaya koymuştur. Buna ek olarak, TLR4 yolağının uyarılması sonucunda EoL-1 hücreleri IL-6 salgılamış olsa da TLR5 ligandı bakteri kamçısıyla uyarılan hücrelerde IL-6 salgılanması gerçekleşmemiştir. Ve NLRC4 ifadesinin %40 oranında azaltılmasının IL-1β salgılanmasını hem biyolojik hem de istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde azalttığı gözlemlenmiştir. Dahası, EoL-1 hücrelerinin insan eozinofilleriyle çeşitli benzer özelliklere sahip olduğu bu çalışmayla tekrar teyit edilmiştir. Bu hücreler, eozinofillerin bölünmesine ve aktifleşmesine yol açan IL-5Rα reseptörünü ve alerjik reaksiyonlarla ilişkili ve eozinofillerin ifade ettiği bilinen IgE reseptörü FcεR2'yi ifade etmektedirler. Ayrıca, EoL-1 hücreleri, uyarılmaları durumunda bir diğer IgE reseptörü FcεR1α ve bağışıklık sistemini düzenleyen ve enflamasyonu baskılayan Siglec 8 reseptörünü ifade etmektedirler. Bu bulgular bize EoL-1 hücrelerinin, eozinofilik fonksiyonların araştırılmasında iyi bir model sunduğunu göstermektedir. PRR'lerin eozinofilik fonskiyonların oluşturulmasında ve Th2 yanıtlarıyla ilişki içerisinde olduğuna dair çalışmalar bulunmaktadır. Bu projeden elde edilen sonuçların ışığında, NLR ve TLR aktivasyonunun eozinofilik fonksiyonlar üzerinde pozitif etkileri olduğu ortaya konmuştur. TLR2 agonisti olan PAM stimülasyonu ve kamçı transfeksiyonu IL-5Rα ve FcεR2 ifade eden hücre sayısını arttırmıştır. Bunun yanında, NRLC4 aktivasyonu FcεR1α ve enflamasyonu baskılayan Siglec 8 reseptörünü ifade eden hücre sayısını arttırmıştır. Buna rağmen, NLRP3 ya da TLR5 ligandlarının bu artış üzerinde herhangi bir etkisi olmamıştır. Eozinofillerin enfeksiyon ya da alerjenlere karşı geliştirdikleri güçlü bağışıklık yanıtlarından ötürü bu hücrelerin bölünmesi son derece sıkı ve sınırlı bir şekilde düzenlenmiştir. Yüzey belirteci IL-5Rα'nın eozinofillerin bölünmesinde ve hayatta kalmasında önemli fonksiyonel rolleri vardır. Bu çalışmada, NLRC4 ve IL-5Rα arasında karşılıklı bir ilişki ortaya konmuştur. IL-5 ile uyarılan EoL-1 hücrelerinde NLRC4 protein ifadesi uyarılmayan hücrelere göre artmıştır. Hem PAM3CSK4 hem de bakteri kamçısı ile uyarılan örneklerde ise sadece PAM3CSK4 ile uyarılan hücrelere kıyasla IL-5Rα ifade eden hücre sayısında artış yaşanmıştır. Eozinofillerin, özellikle de belli uyaranlarla uyarılmaları durumunda antijen sunma kapasitelerinin arttığını ortaya koyan çalışmalar yayınlanmıştır. Bu proje içerisinde gerçekleştirilen akan hücre ölçer deneylerinin sonuçları, uyarılmamış EoL-1 hücrelerinin CD80 ve CD86 ifade ettiklerini göstermiştir. Dahası, TLR2 aktivasyonu CD80 ifade hücre sayısını arttırmışken NLRP3 ligandı ATP ve NLRC4 ligandı kamçı ile uyarılan hücrelerde daha da büyük bir artış yaşanmıştır. Projeden elde edilen bulgulara dayanarak, NLRC4'ün alerjik reaksiyonlarla daha yakından ilişkili olduğu ve TLR sinyal yolağının ise daha genel ve geniş bir bağışıklık yanıtı yelpazesine yol açtığı ileri sürülebilir. Bundan ötürü, bulgularımız eozinofilik fonksiyonların karakterizasyonu ve alerjik reaksiyonlarda muhtemel hedefler belirlerken bir yandan da PRR'ler ve eozinofilik fonksiyonlar arasındaki ilişkinin kavranmasında yeni bir çerçeve de sunmaktadır.

Özet (Çeviri)

The immune system is a set of complex and dynamic mechanisms, that protects the body against pathogens and maintain homeostatic balance in the presence of an internal disruption. Besides its protective roles against pathogens, the immune system is intertwined with the large scale systems such as the nervous system and different types of metabolic systems and constitutes a variety of sophisticated multi-dimensional mechanisms ranging from antibody production to tissue remodeling. The immune system consists of two distint categories; innate immunity and adaptive immunity which are interrelated. The innate immunity is much more rapid and abundant whereas the adaptive immunity develops specific responses upon encountering a pathogen in concert with the innate immunity. Additionally, the adaptive immunity generates a memory mechanism to fight off the pathogens that have already been encountered. Innate immune responses are generally regulated by conserved yet limited set of Pattern Recognition Receptors (PRRs). PRRs contain two types of receptors: membrane bound and cytosolic receptors. While Toll-like receptors (TLRs) and C-type lectin receptors (CLRs) are considered membrane bound, NOD-like receptors (NLRs) and RIG-I-like receptors (RLR) are considered cytoplasmic PRRs. This thesis involves a comprehensive set of experimental studies designed to deepen the knowledge of NLRC4 and its activation through TLRs. Members of the TLR family are transmembrane receptors that have critical roles in promoting rapid and diverse pro-inflammatory responses. For instance, TLR2 recognizes microbial glycolipids and lipopeptides whereas TLR 4 recognizes lipopolysaccharides. TLR 5, another surface TLR, recognizes bacterial flagella. Activation of TLR signaling pathways result in the expression of a broad range of pro-inflammatory cytokines and receptors such as IL-1, IL-6, IL-12, IL-18 and CD80, CD86. NLRs are cytosolic PRRs that are induced by molecular patterns of pathogens or damage associated molecular patterns (DAMPs). The NLR family consists of 22 members in humans. NLRs consist of three main domains: a C-terminal LRR domain that sense microbial molecules or danger associated molecules, a central NACHT domain that mediates NLR oligomerization and an N-terminal domain which activates signal transduction. NLRP3 is probably the most studied and well-characterized member of the NLR family. As a member of the NLRP subfamily, NLRP3 constitutes a PYRIN domain and inflammasome assembly upon ligand recognition by NLRP3 requires the adaptor protein ASC. NLRC4, on the other hand, does not have a PYRIN domain and can form inflammasome with or without the interaction with the adaptor protein ASC. Upon activation, both of the members of the NLR family are reported to form protein complexes known as inflammasomes and this activation results in cleavage and secretion of the cytokines IL-18 and IL-1β into their biologically active forms. Eosinophils play critical roles in the defence againts extracellular parasites and in the development of allergic responses. Since they develop extensive inflammatory responses, eosinophils are not abundant in the human blood, only constituting 1-6% of all white blood cells. And even though NLRC4 and NLRP3 are well-studied in other contexts and white blood cells, their roles in shaping the eosinophilic functions are relatively unknown. Since eosinophils are sparse in the human blood, we used the human eosinophilic leukemia cell line EoL-1 which provides a model for the investigation of eosinophilic functions. To characterize the functions of PRRs in general and NLRs in particular, we first analyzed the expression levels of NLRC4 and NLRP3 and the expression of eosinophilic markers at both mRNA and protein level. We have observed that in the eosinophil like EoL-1 cells, NLRC4 and NLRP3 are expressed both at mRNA and protein levels. We have also observed that NLRC4 mRNA and protein levels are augmented upon induction with two signals, signal 1 being the TLR ligand and signal 2 being the NLRC4 ligand, transfected flagella. Moreover, our western blotting results demonstrated that in EoL-1 cells NLRC4 and NLRP3 inflammasomes were activated and caspase-1 and IL-1β are cleaved into their active forms in EoL-1 cells upon induction with NLRC4 and NLRP3 ligands. Our ELISA results also displayed that EoL-1 cells secreted the cytokine IL-1β at 24 hour NLRC4 poststimulation and 10 hour NLRP3 poststimulation. EoL-1 cells also secreted the inflammasome independent cytokine IL-6 upon TLR4 induction but stimulation with flagella alone without transfection did not cause any IL-6 secretion in these cells. Of note, 40% NLRC4 knockdown was sufficient to detect both biologically and statistically meaningful decline in the secretion of IL-1β. Furthermore, we verified that EoL-1 cells display a number of specific characteristics of human eosinophils. They express IL-5 receptor IL-5Rα which takes part in the survival and activation of eosinophils and the allergy related IgE low affinity receptor FcεR2 which is expressed on eosinophils. Additionally, EoL-1 cells expressed the high affinity Fc epsilon receptor FcεR1α and the immunoregulatory Siglec-8 protein upon induction. Hence, it is safe to say that EoL-1 cells provide a good model for the investigation of eosinophilic functions. There are studies underlying the effects of PRRs on eosinophilic functions and their involvement and relationship with the Th2 responses. In the light of this study, we have shown the positive effects of NLR and TLR induction in promoting the eosinophilic functions. PAM3CSK4 (TLR2 agonist) stimulation and flagella transfection both significantly elevated the number of EoL-1 cells expressing the eosinophilic marker IL-5Rα and low affinity Fc epsilon receptor FcεR2. Additionally, NLRC4 activation led to an increase in the high affinity Fc epsilon receptor FcεR1α and Siglec-8 expressing cells. Nevertheless, NLRP3 or TLR5 induction had no impact on the expression of the above mentioned receptors. Because eosinophils respond in extensive measures to infections or allergens, their proliferation must be tightly regulated and limited. The functional roles of the surface receptor IL-5Rα is of great importance in the survival of the eosinophils and their activation. We observed a reciprocal relationship between NLRC4 and the IL-5Rα. EoL-1 cells expressed higher levels of NLRC4 protein when cells were stimulated with IL-5 as compared to non-stimulated cells. Interestingly, percentage of IL-5Rα expressing EoL-1 cells were higher in cells that are stimulated with PAM3CSK4 and flagella than cells stimulated with PAM3CSK4 alone. A few studies reported the antigen presenting capabilities of eosinophils upon activation. Our flow cytometry results suggest that non-treated EoL-1 cells expressed CD80 and CD86. Stimulation of cells via NLRP3 and NLRC4 axis with TLR2 agonist caused an increase in the number of CD80 expressing cells and ATP treatment and flagella transfection even further increased this effect. On the basis of current data, NLRC4 could be deduced to be more closely related to allergic responses while TLR signaling promotes more general, global immune responses in EoL-1 cells. Taken together, our findings present potential targets for both the further characterization of eosinophilic functions and allergic responses coupled with a new frame of thoughts to understand the relationship between PRRs and eosinophilic functions.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    520305

    Molecular genetic characterization of nod-like receptor 11 (NLRP11) in the regulation of adaptive immune responses

    Edinsel bağışıklık cevabının düzenlenmesinde nod-benzeri reseptör 11 (NLRP11)'in moleküler genetik karakterizasyonu

    İREM ÖZEL

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2018

    Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyokimya ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. CEREN ÇIRACI

  2. Tez No

    864255

    Molecular characterization of interactions in Drosophila circadian photoreceptor

    Drosophila sirkadyan fotoreseptöründeki etkileşimlerin moleküler karakterizasyonu

    GÖZDE ÖZÇELİK

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2024

    BiyolojiGebze Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. NURİ ÖZTÜRK

  3. Tez No

    473018

    A comprehensive study of K-Ras protein and its oncogenic mutations: A dynamic point of view

    K-Ras proteini ve onkojenik mutasyonları üzerine kapsamlı bir çalışma: Dinamik bir bakış açısı

    SEZEN VATANSEVER

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    BiyofizikKoç Üniversitesi

    Biyomedikal Bilimler ve Mühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. BURAK ERMAN

  4. Tez No

    808949

    Investigation of NFİB function and regulation of its putative target genes in human neural stem cell and SH-SY5Y neuroblastoma cell lines

    İnsan sinir kök hücre ve SH-SY5Y nöroblastom hücre hatlarında NFIB işlevinin ve potansiyel hedef genlerinin regülasyonunun incelenmesi

    BETÜL ULUCA

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ ASLI KUMBASAR

  5. Tez No

    389423

    Molecular characterization of Helicobacter-activated B cells

    Helıcobacter-aktive B hücrelerinin moleküler karakterizasyonu

    NESTEREN MANSUR

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2014

    Allerji ve İmmünolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. AYÇA SAYI YAZGAN

Geri Dön