Geri Dön

Molecular genetic characterization of nod-like receptor 11 (NLRP11) in the regulation of adaptive immune responses

Edinsel bağışıklık cevabının düzenlenmesinde nod-benzeri reseptör 11 (NLRP11)'in moleküler genetik karakterizasyonu

PDF İndir

  1. Tez No: 520305
  2. Yazar: İREM ÖZEL
  3. Danışmanlar: DOÇ. DR. CEREN ÇIRACI
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoloji, Biology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2018
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyokimya ve Genetik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: İmmünoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 97

Özet

Bütün organizmalar patojenlere, yabancı maddelere ve rakiplerine karşı savaşmak adına en az bir çeşit savunma mekanizması geliştirmişlerdir. İnsanlar da dahil olmak üzere gelişmiş omurgalılar, 'bağışıklık sistemi' olarak da bilinen savunma mekanizmalarının en sofistike, en etkili ve en iyi organize olmuş biçimine sahiptirler. Yüksek omurgalılarda gördüğümüz bağışıklık sisteminin bu becerikliliği, bünyesinde barındırdığı doğuştan gelen 'doğal bağışıklığın' ve sonradan kazanılan 'edinsel (adaptif) bağışıklığın' birbirinden farklı ve birbirini tamamlayıcı etki mekanizmalarından kaynaklanır. Doğal bağışıklık enfeksiyona saatler içerisinde yanıt verir ve patojen kaynağını spesifik olmayan bir şekilde giderir. Buna karşılık olarak patojenler de doğal bağışıklıktan kaçmak için mekanizmalar geliştirmişlerdir. Bu patojenler bir takım mekanizmalarla doğal bağışıklığı atlarak enfeksiyon oluşturabilir. Doğal bağışıklık atlatıldığında patojenler bu kez, etkisi daha kuvvetli ve daha uzun süren, üstelik belirli bir patojene spesifik yanıt geliştiren edinsel bağışıklıkla karşılaşır. Bu iki sistem farklı aşamalarda ve farklı özelliklerde ancak birbirlerini tamamlayıcı ve uyum içerisinde çalışarak patojenlere karşı etkili bir savunma geliştirirler. Ancak edinsel bağışıklığı, doğuştan gelen bağışıklıktan ayıran katı çizgi uzun zamandır bulanıklaşmıştır. Doğal bağışıklık bileşenlerinin adaptif bağışıklığın düzenlenmesinde rolleri olabileceği artık bilinmektedir. Ayrıca, kalıp tanıma reseptörleri olarak bilinen Toll-benzeri reseptörler ve Nod-benzeri reseptörler gibi doğal bağışıklığın bazı elemanları edinsel immünitenin hücrelerinde de bulunur. Bu reseptörler patojen varlığının farkedilmesini ve ardından immün yanıtın başlatılmasını sağlalar. Fakat ne yazık ki Toll-benzeri reseptörler ve Nod benzeri reseptörler, adaptif bağışıklık düzenlemesi bağlamında pek fazla araştırılmamıştır. NLR ailesi PRR ailesinin nispeten yeni keşfedilmiş üyeleridir. Bu ailenin işlevleri neredeyse sadece doğal bağışıklık yönünden incelenmiştir. İnsanlarda NLR ailesinin bilinen 22 üyesi vardır ve bunlardan 4'ü inflamazom kompleksi olarak adlandırılan çoklu protein kompleksi oluşturmaktadır. İnflamazom kompleksi oluşturmanın yanısıra, NLR ailesinin arteroskleroz, tip II diyabet, obezite, Alzheimer, gut ve bakteri, virüs, parazit enfeksiyonları gibi çeşitli hastalıklarla ilişkileri olduğu gösterilmiştir. NLR ailesinin en yeni keşfedilen üyelerinden biri olan Nod-benzeri reseptör protein 11 sadece primatlarda eksprese olmaktadır. NLRP11 proteininin hücresel işlevi ve bu proteini aktive eden spesifik ligand(lar) bilinmemektedir. Bu tez, primatlarda ifade edilen bir Nod-benzeri reseptör ailesi üyesi olan NLRP11'in moleküler analizine odaklanmaktadır. NLRP11 hakkında yok denecek kadar az literatür bilgisi bulunmaktadır ve NLRP11 ile ilgili yapılan çalışmalar oldukça kısıtlıdır. Dolayısıyla Nod-benzeri reseptör ailesinin bu üyesinin bağışıklık sistemde ne gibi roller üstlendiği ve edinsel bağışıklık sistemini koordine etmede düzenleyici bir görevinin olup olmadığı büyük ölçüde bilinmemektedir. NLRP11'in insan Burkitt lenfoma hücrelerinden biri olan Daudi hücrelerinde yüksek oranda eksprese olması nedeniyle, deneyler boyunca bu hücre hattı kullanılmıştır. NLRP11'i aktive eden spesifik ligandlar bilinmediğinden LPS, CD40L, PMA/iono gibi çeşitli liganlar kullanılmıştır. Daudi hücreleri ayrıca adenosin A2A reseptörünü de yüksek oranda eksprese etmektedir. Adenozin reseptörleri (A1, A2A, A2B ve A3), adenozinin biyolojik etkilerine aracılık eden G-protein bağlı reseptörlerdir. Adenozin bir purin nükleozittir. Birçok bağışıklık hücresi üzerindeki purinerjik reseptörlerine bağlandıktan sonra adenozin, bağışıklık sistemin yanıtlarını regüle etmektedir. A2A reseptörüne bağlanarak adenozin, immün yanıtın baskılanmasına neden olmaktadır. Bu yönü nedeniyle adenozin birçok tümör hücresi tarafından bağışılık sistemin hücrelerinden kaçmak için kullanılmaktadır. Genel bir uyarıcıdan ziyade spesifik bir uyarıcı olan adenozinin etkilerini görmek içinbu tezde RT-qPCR ve western blot analizleri yapılmıştır. Yapılan bu analizler sonucunda NLRP11'in, bir anti-enflamatuar bileşik olan, adenozin ile stimülasyondan sonra hem mRNA hem de protein seviyelerinde arttığı tespit edilmiştir. Ayrıca, adenozin uyarımının süreleri arasındaki farklılıklar ile birlikte farklı adenozinin dozlarının etkileri araştırılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre, optimum adenozin konsantrasyonu 50 μM ve stimülasyon sonrası optimum 4 saat olarak seçilmiştir. Genel sonuçlar, NLRP11'in LPS, CD40L ve PMA/ionomycin uyarımına değil, adenozin uyarımına yanıt olarak artmış bir şekilde Daudi hücrelerinde ifade edildiği hipotezimizi kuvvetle desteklemektedir. Adenozinin NLRP11 üzerindeki arttırıcı etkisini doğrulamak için Adenozin A2A reseptörünün antagonisti olan ve adenosinin etkisini engellediği bilinen kafein kullanılmıştır. Sonuç olarak, kafeinin Daudi hücrelerinde adenozinin tersine etki yaparak, NLRP11 ekspresyonunu azalttığı gözlemlenmiştir. Bu bulgu NLRP11 in bir adenozin reseptörü tarafından control ediliyor olabileceği hipotezimizi desteklemektedir. NLRP1, NLRP3, NLRC4 ve AIM2 gibi NLR proteinlerinin aktivasyonunun ASC proteini ve kaspaz-1 enzimi içeren, inflamazom adı verilen çoklu protein kompleksinin oluşumuna neden olduğu bilinmektedir. Kaspaz-1 enziminin aktifleşmesi, IL-1β (İnterlökin-1β) ve IL-18 gibi pro-inflamatuar sitokinlerin olgun formlarına kesilmesi ile sonuçlam-nmaktadır. Daudi hücrelerinde adenozin yardımıyla artan NLRP11'in bir inflamazom kompleksi oluşturup oluşturmadığını incelemek adına, inflamzom üyelerinden ASC ile etkileşimleri araştırılmıştır. ASC ile NLRP11 etkileşimini anlamak için yapılan Ko-immünopresipitasyon (Birlikte-immün çöktürme) analizi, NLRP11'in adenozin ile stimülasyondan sonra ASC adaptör proteinine bağlandığını göstermiştir. Bununla birlikte, muhtemel bir inflamazom kompleksinin varlığını işaret eden olgun IL-1β ve IL-18 sitokinlerinin hücrelerden salgılanması, NLRP11-ASC etkileşimi sonrasında gözlenmemiştir. Ancak bu sitokinler mRNA seviyesinde Daudi hücrelerinde ifade edilmektedir. Bu bulgu, adenozin ile uyarılan Daudi hücrelerinde inflamazom kompleksinin bir diğer üyesi olan kaspaz-1 enziminin, NLRP11-ASC etkileşiminin neticesinde aktive olup olmadığı sorusunu gündeme getirmiştir. Kaspaz-1 enziminin aktivazyon durumu incelendiğinde adenozin uyarımının bu enzimin aktivasyonunu azaltığı gözlemlenmiştir. Ancak kaspaz-1 aktivasyon deneylerinin optimize edilmesi ve tekrarlanması gerekmektedir. B hücrelerinin bir diğer fonksiyonuda T hücrelerine antijen sunmaktır. B hücreleri T hücreleri ile etkileşime girerek daha kaliteli antikorlar üretmekte ve T hücresi yanıtını yönlendirebilmektedir. Daudi hücrelerinde NLPR11'in fonksiyonunu değerlendirdikten sonra, NLRP11'in; B hücreleri ile etkileşime giren insan primer T hücreleri üzerinden edinsel bağışıklık yanıtına etkisi bu tez ile incelenmiştir. Kısaca, NLRP11 ile ilgili çalışmalarımız NLR ailesinin bu üyesinin adaptif immün yanıtı nasıl şekillendirdiğini araştırmaktadır. Bu amaçla öncelikle antijen sunan hücre yeteneğini değerlendirmek için Daudi hücrelerinde B7.1 (CD80) ve B7.2 (CD86) yardımcı uyarıcı moleküllerin ekspresyon düzeyleri flow sitometri yöntemiyle incelenmiştir. Daudi hücrelerinin tipik bir antijen sunan hücre karakteristiği göstererek, bu yardımcı uyarıcı molekülleri hücre yüzyinde eksprese ettiği, ancak bu moleküllerin ekspresyon düzeylerinin NLRP11'e bağımlı olmadığı tespit edilmiştir. NLRP11'in T hücresi yanıtına etkisinin daha kapsamlı incelenebilmesi için, Daudi hücrelerinde NLRP11'in seviyesi siRNA ile azaltıldıktan sonra, kandan izole edilen insan primer CD4+ T hücreleri ile birlikte kültüre edilip, NLRP11'in T hücresi farklılaşmasına etkisinin anlaşılabilmesi için, primer CD4+ T hücrelerinden sitokin salınımı araştırılmıştır. Primer CD4+ T hücre sitokinlerinin analizi, NLRP11'in Th1 ve Th17 yanıtlarının baskılanmasına yol açtığnı ve siRNA ile NLRP11 protein seviyesinin azlatılması bu Thq ve Th17 yanıtlarının geri kazanılmasına sebep olduğunu göstermiştir. Ancak NLRP11 protein seviyesideki değişikliklerin Th2 ve Treg yanıtlarında belirgin farklılıklara neden olmadığı bulunmuştur. Bulgularımız, NLRP11'in inflamasyon ve edinsel bağışıklık sistemdeki rolleri hakkında aydınlatıcı ve ümit verici bilgiler vermenin yanı sıra, NLRP11'in T hücresi farklılaşmasını düzenlediği mekanizmayı anlamak için daha ileri çalışmalara zemin hazırlamakta ve T hücre yanıtı eksikliklerinden kaynaklanan bağışıklık sistemi ile ilişkili hastalıların tedavisi için yeni hedeflerin olasılığını arttırmaktadır.

Özet (Çeviri)

Virtually all organisms have at least a rudimentary defense mechanism to fight invaders, foreign substances or rivals. Comparatively speaking, the immune system of advanced vertebrates, including humans, is a sophisticated, compartmentalized and well-organized defense mechanism. The distinct effector mechanisms of the innate immunity and the adaptive immunity provide the versatility for the immune system of higher vertebrates. The innate immune system takes action within hours of infection and eliminates pathogens in a non-specific manner. However, in the event that a pathogen evades the innate immune response, an infection develops. When the innate immunity is breached, the adaptive immune system is activated and functions in the eradication of specific pathogens. Even though the immune system is categorized into two distinct components, recent studies suggest that there is no clear line seperating the innate immunity from adaptive immunity. For example, it is now clear that components of the innate immune system have roles in the regulation of the adaptive immune system. Furthermore, Patern Recognition Receptors (PRRs) of the innate immunity such as Toll-like receptors (TLRs) and Nod-like receptors (NLRs) can also be found in the cells of the adaptive immunity. Unlike Toll-like receptors, however, Nod-like receptors have not been widely studied in the context of regulation of adaptive immunity. The NLR family is a relatively newly discovered family of PRRs whose functions have been examined almost exclusively in the innate immunity. There are 22 known members of the NLR family in humans, four of which form a multiprotein complex called the inflammasome complex. Aside from inflammasome complex formation, the NLR family has been shown to have associations with several diseases including artherosclerosis, type II diabetes, obesity, Alzheimer's disease, gout and bacterial, viral and parasite infections. One of the most recent discovered members of the NLR family, NLR family Pyrin Containing 11 /NLRP11), is expressed only in primates: however, its cellular functions as well as the specific stimulant(s) that activate it are unknown. As stated above, the function of NLRP11 remains elusive and the regulatory role of NLRP11 in coordinating the adaptive immune system is uncharted territory. In an effort to remedy this dearth of information, we focused in this thesis on the molecular analysis of NLRP11. Because NLRP11 is expressed in Daudi cells, a human Burkitt's B cell lymphoma cell line, we used Daudi cells as a model throughout our experiments. Since the ligand for NLRP11 has not yet been identified, we selected several stimulants including CD40L, PMA/Ionomycine, LPS and adenosine, and screened them to determine whether or not NLRP11 was inducible in Daudi cells. With the exception of adenosine, all these stimulants are commonly used to induce an immune response and the formation of an inflammasome complex in immune cells. We included adenosine in the experiments because of the relatively high expression of the adenosine receptor A2A on Daudi cells. A1, A2A, A2B and A3 adenosine receptors are G-protein-coupled receptors that mediate the biological actions of adenosine, a purin nucleoside. Upon binding to its purinergic receptors which are found on several types of immune cells, adenosine modulates immune responses. The binding of adenosine to A2A and A2B receptors results in immunosuppression. To further investigate the effects of adenosine on NLRP11 expression, we performed western blot analysis and quantitative reverse transcriptase PCR (RT-qPCR). We first tested the effects of dose and duration of treatment and found 50 µM adenosine for 4 hours of stimulation was the optimum condition. We discovered that both mRNA and protein levels of NLRP11 are increased in Daudi cells at 4 hour post-stimulation with adenosine. Overall, these results strongly support our hypothesis that the NLRP11 expression is increased in Daudi cells in response to adenosine stimulation but not to CD40L, PMA/Ionomycine or LPS. To further validate the effect of adenosine on NLRP11, Daudi cells were stimulated with the adenosine inhibitor caffeine, an antagonist of the adenosine A2A receptor. These results indicated that the expression levels of NLRP11 are downregulated in response to caffeine further evidence that NLRP11 regulation might be mediated by an adenosine receptor. Activation of NLR family members AIM2, NLRP1, NLRC4 and NLRP3 results in the formation of a multi-protein complex, the inflammasome, which contains the ASC (Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD) adaptor protein and the cysteine protease caspase-1. Activation of caspase-1 results in the cleavage and maturation of the pro-inflammatory cytokines IL1β (Interleukin-1β) and IL-18. To date, NLRP11 protein has not been reported to form an inflammasome complex via an interaction with ASC and caspase-1 proteins. We reasoned that because of NLRP11 is highly expressed in Daudi, B cell lymphoma, cell line, it might possibly be involved in a dual or triple interaction with ASC and/or caspase-1. We then tested this possibility using a co-immunoprecipitation (Co-IP) assay. The Co-IP assays demonstrated that NLRP11 indeed binds to the ASC adaptor protein after stimulation with adenosine. However, IL1β and IL18 cytokines were not secreted at the protein level in response to the NLRP11-ASC interaction, although we were able to measure these cytokines at the mRNA level by qPCR. We then proceeded to check the caspase-1 activity after stimulating Daudi cells with adenosine. Results from these particular experiments were inconclusive and necessitate optimization for the accurate measurement of caspase-1 activity. B cells are Antigen Presenting Cells (APC) that produce higher quality antibodies upon interaction with T cells. Because of Daudi cells are a B-cell lymphoma cell line, we used these cells to examine what role, if any, NLRP11 played in the interaction between human primary T cells and B cells; in other words, to investigate the role of this NLR family member in shaping the adaptive immune responses. For this purpose, we first verified that Daudi cells have the characteristics of antigen presenting cells for co-culture experiments; therefore, we examined the expression levels of co-stimulatory molecules B7.1 (CD80) and B7.2 (CD86) on Daudi cells. We found that Daudi cells express these co-stimulatory molecules; however, their expression levels are not dependent on NLRP11. We next induced downregulation of NLRP11 in Daudi cells using siRNA (small interfering RNA) and co-cultured these Daudi cells with blood-derived human primary CD4+ T cells. Cytokine release from the CD4+ T cells in the co-culture condition was measured to understand the effect of NLRP11 on T cell polarization. We found that co-culturing with Daudi cells suppressed both Th1 (T Helper 1) and Th17 (T Helper 17) responses, while downregulation of NLRP11 in Daudi cells led to the recovery of these Th1 and Th17 responses, but did not cause any significant changes in Th2 (T helper 2) and Treg (Regulatory T cell) responses when co-cultured with CD4+ T cells. Our findings raise the possibility of new targets for treatment of immune system related diseases originating from deficient T cell responses and lay the groundwork for further studies to understand the mechanism by which NLRP11 regulates T cell skewing.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    562496

    CHARACTERIZATION OF THE REGULATORY MECHANISMS OF NOD LIKE RECEPTORS IN THE GENERATION OF IMMUNE RESPONSES: REVISITING NLRC4 IN EOSINOPHILIC FUNCTIONS IN VITRO

    BİR EDİNSEL BAĞIŞIKLIK OLAN T2 HÜCRE CEVABININ NOD BENZERİ RESEPTÖRLERİ (NLR) İLE REGÜLASYON MEKANİZMALARININ KARAKTERİZASYONU

    ILGIN AKKAYA

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2019

    Allerji ve İmmünolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. CEREN ÇIRACI

  2. Tez No

    286417

    Cloning and characterization of novel NOD like receptors as cytoplasmic immune sensors

    Sitoplazmik bağışıklık alıcıları olarak yeni NOD ailesi alıcıların klonlanması ve karakterizasyonu

    YETİŞ GÜLTEKİN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2011

    BiyolojiBoğaziçi Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. NESRİN ÖZÖREN

  3. Tez No

    409274

    Characterization of NLRP13 in inflammasome activity

    NLRP13'ün enflamasyon aktivitesindeki rolünün tanımlanması

    MUSTAFA YALÇINKAYA

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2015

    BiyolojiBoğaziçi Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. NESRİN ÖZÖREN

  4. Tez No

    420254

    Studies on molecular and genetic characterization of the genes responsible for the multicarpellary gynoecium in Thermopsis turcica

    Thermopsis turcica'da çoklu karpel oluşumundan sorumlu olan genlerin moleküler ve genetiksel karakterizasyonu üzerine çalışmalar

    DİLEK TEKDAL

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2015

    Bilim ve TeknolojiSabancı Üniversitesi

    Biyoloji Bilimleri ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MEHMET SELİM ÇETİNER

  5. Tez No

    380330

    Yabancı kökenli bazı bakla (Vicia faba L.) populasyonlarındaki genetik çeşitliliğin moleküler karakterizasyonu

    Molecular characterization of genetic diversity in some faba bean (Vicia faba L.) populations

    HİDAYET TUFAN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2015

    ZiraatMustafa Kemal Üniversitesi

    Tarla Bitkileri Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. CAHİT ERDOĞAN

Geri Dön