The Effects of cysteine 43 mutation on catalytic properties and thermostability of thermoplasma acidophilum citrate synthase
Sistein-43 mutasyonunun thermoplasma acidoplium sitrat sentetaz enziminin katalitik özellikleri ve yüksek ısıya dayanıklılığı üzerindeki etkileri
- Tez No: 56669
- Danışmanlar: PROF. DR. SEMRA KOCABIYIK
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Thermoplasma acidophilum, sitrat sentetaz, termofiller, Archaea, ısıya dayanıklılık. vı, Enzimler, Sitrat sentez, Yüksek sıcaklık, Enzymes, Sitrat synthase, Thermoplasma acidophilum, High temperature
- Yıl: 1996
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
oz SİSTEİN-43 MUTASYONUNUN THERMOPLASMA ACIDOPHILUM SİTRAT SENTETAZ ENZİMİNİN KATALİTİK ÖZELLİKLERİ VE YÜKSEK ISIYA DAYANIKLILI?I ÜZERİNDEKİ ETKİLERİ Erduran, İpek Yüksek Lisans, Biyoloji Bölümü Tez Yöneticisi: Prof. Dr. Semra Kocabıyık Ocak 1996, 70 sayfa Sitrik asit döngüsünün girişindeki reaksiyonu katalizleyen sitrat sentetaz enzim mekanizması, enzim substrat ilişkisi, konformasyon değişiklikleri, protein kıvrılma ve bükülmelerini araştırmak için önde gelen sistemi oluşturur. Bu çalışmada proteinin yüksek ısıya dayanıklılığını moleküler bazda araştırmak amacıyla termofilik Archaeon, Thermoplasma acidophililum 'un sitrat sentetaz enzimini seçtik. İleriki çalışmalarda rekombinant enzimin belirli yerlerinin işaretlenip, bu yerlerin yapı ve bölgesel dinamik hareketlerini spektrofotometrik yöntemle inceleyebilmek için protien mühendisliği metodu ile enzimin bu noktalarının değiştirilmesi hedeflendi. Thermoplasma sitrat sentetazm üç boyutlu yapısı göz önüne alınarak seçilen iki değişik pozisyona (Ser-43 ve Ser-309) sistein grupları eklendi. Bu çalışmada, Cys-43 mutasyonunun enzimin biyokimyasal ve yüksek ısıya dayanıklılığı üzerindeki etkileri araştırılmıştır.Mutant ve mutant olmayan rekombinant enzimler Matrex Gel Red A affiniti kromatografisi sayesinde, substrat oksaloasetat ve ürün koenzimA karışımı ilave edilerek saf halde elde edilmiştir. Mutant olmayan enzimin 6.9 kat, mutantın ise 9.3 kat saf olduğu bulunmuştur. Kinetik özelliklerine bakıldığında, katalitik olarak iki enzimi birbirinden farklı olmadığı gözlenmiştir. Oksaloasetat için mutant olmayan enzimin Km değeri 1 0 |iM, mutant enziminki ise 1 0.2\ıM, asetil koenzim A için her biri söylediği sıraya göre 10.6 jıM ve 10.8 \ıM olarak bulunmuştur. Her iki enziminde 70°C 'da aktivitelerini sürdürüğü, 80°C 'da ise yan ömürün mutant olmayan için 23 dak., mutant enzim için 21 dak. olduğu bulunmuştur. Enzimlerin pH profilleri de benzer olup, optimum aktivite pH 8 'de gözlenmiştir. Mutant enzimdeki yeni Cys-43 grubu DTNB ile modifiye edilebilmiştir. Bu da eklenen -SH grubunun modifikasyonlara açık olduğunu göstermektedir.
Özet (Çeviri)
ABSTRACT THE EFFECT OF CYSTEINE-43 MUTATION ON CATALYTIC PROPERTIES AND THERMOSTABILITY OF THERMOPLASMA AC1DOPHILUM CITRATE SYNTHASE Erduran, İpek M.S., Department of Biology Supervisor: Prof. Dr. Semra Kocabıyık January 1996, 70 pages The enzyme citrate synthase, vvhich catalyzes the reaction at the entry to the citric acid cycle, forms an outstanding system for investigation of enzymatic mechanisms, enzyme-substrate interactions, conformational change.and protein folding. in this study we have selected citrate synthase from a moderately thermophlic Archaeon, Thermoplasma acidophilum, as a model enzyme for an investigation into the molecular basis of protein thermostability. We have aimed engineering of the recombinant enzyme for site-specific attachment of labels to map the structure and local dynamic processes by spectroscopy in future studies. Two cysteine residues were introduced separately to the selected positions (Ser-43 and Ser-309) vvhich were defined on the 3D structure of the Thermoplasma citrate synthase. in the present study, we have investigated the effects of Cys-43 mutation on the biochemical properties and thermal stability of the enzyme. Both wild-type and mutant enzymes were purified to homogenity using affinity chromatography on Matrex Gel Red A and elution with a combination of substrate oxaloacetate and product coenzyme A. İÜThe enzymes were purified to 6.9 and 9.3-fold for wild-type and Cys-43 mutant, respectively. The kinetic properties of the purified Thermoplasma enzymes indicated that the expressed wild-type and mutant citrate synthases were catalytically indistinguishable. Km for oxaloacetate of wild-type and mutant enzymes were 10 jiM and 10.2 jıM, and Km for acetyl-CoA were 10.6 fiM and 10.8 (iM, respectively. Both enzymes were stable at 70°C. The half-life of the wild-type enzyme was 23 min., mutant enzyme's was 21 min. at 80°C. Both enzymes exhibited similar pH profiles with optimum activity at pH 8. The newly introduced Cys-43 residue in the mutant enzyme could be easily modified by DTNB. This might indicate the accessibility of the respective -SH group for modifications. Key vvords: Thermoplasma acidophilum, citrate synthase, thermophile, Archaea, thermostability.
Benzer Tezler
- Durum wheat metallothionein mutants and their biophysical characterization
Makarnalık buğday metallotionin mutantları ve biyofiziksel karakterizasyonu
CEREN SAYGI
- The productıon and pegylatıon of recombinant human granulocyte colony-stımulatıng factor produced ın e. coli
Rekombinant insan granulosit koloni stimülan faktörünün e. coli'de üretimi ve pegilasyonu
NAZLI DİLARA ERDOĞDU
Yüksek Lisans
İngilizce
2023
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
- Sıçanlarda sisplatin ile oluşturulan ovaryum hasarına sarımsağın organosülfür komponentlerinden S-Allil-L-Sistein ve Allil Disülfit'in etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of organosulfide components of garlic, S-Allyl-L-Cysteine and allyl disulfite, on cisplatin-induced ovarian damage in rats
HİLAL ARSLAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2021
Histoloji ve EmbriyolojiSağlık Bilimleri ÜniversitesiHistoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ HALİME TUBA CANBAZ
- Muşmuladan (Mespilus germanica) izole edilen polifenol oksidaz enziminin aktivitesi üzerine amino asitlerin inhibisyon etkileri
Inhibition effects of amino acids on the activity of polyphenol oxidase enzyme isolated from medlar (Mespilus germanica)
EREN ÖZDEMİR
Yüksek Lisans
Türkçe
2023
BiyokimyaYıldız Teknik ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. EMİNE KARAKUŞ
DR. ÖĞR. ÜYESİ ÇİĞDEM BİLEN
- Anilino pirimidin grubu fungusitlerinden pirimetanilin elektrokimyasal tayini için yöntem geliştirilmesi
Development of a method for the electrochemical determination of pyrimethanil from anilino pyrimidine group
CENNET FUNDA KİRKİT