Geri Dön

Molecular relationship between bacilysin and surfactin biosynthesis in Bacillus subtilis

Bacillus subtilisde basilisin ve sürfaktin biyosentezi arasındaki moleküler ilişki

PDF İndir

  1. Tez No: 637704
  2. Yazar: DİLAN ERGÜN
  3. Danışmanlar: PROF. DR. AYTEN KARATAŞ
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Mikrobiyoloji, Biotechnology, Microbiology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2020
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 107

Özet

Endospor oluşturabilen, patojenik olmayan, çubuk şeklinde, aerobik bir Gram pozitif toprak bakterisi olan Bacillus subtilis hayvanların gasterointestinal sistemleri ve bitki köklerinde yaşabilir. Besin kıtlığı ve stres faktörlerinin sebep olduğu çevresel değişikliklere geliştirdiği fizyolojik değişimlerle uyum sağlayabilir. B. subtilis, popülasyon yoğunluğuna bağlı olarak üretilen sinyal moleküllerinin algılanması ile biyofilm gelişimi, genetik kompetans gelişimi, antibiyotik üretimi ve sporülasyon gibi çevresel yanıtlar üretir. B. subtilis'in ürettiği çevresel yanıtlar bir sinyalizasyon ağı (quorum sensing) tarafından kontrol edilip düzenlenir. Biyofilm, bakteri hücrelerinin, hücredışı polimerlerden oluşan bir matris (EPS) ve mikro koloniler oluşturarak canlı veya cansız bir yüzeye geri dönüşü olmayan bir şekilde bağlandığı mikrobiyal hücre kümesidir. Mikrobiyal hücre kümesi içindeki bakterilere kendilerini dış faktörlerden korumak için birçok avantaj sağlayan biyofilm yapısı, gen ekspresyonunun hücreler arasındaki iletişime dayalı olarak düzenlenmesi ile hücrelerin çevresel değişimlere uyum sağlamak için ürettiği bir yanıttır. B. subtilis'in tüm genomu sekanslanmıştır ve yaklaşık 4.100 protein kodlama bölgesi olan 4.214.810 baz çiftine (bp) sahiptir. Başlangıçta, Gram-negatif bakteriler biyofilm oluşumunun temel mekanizmalarını araştırmak için kullanılmıştır ancak tüm genom yapısı dizilenen ve patojenik olmayan B. subtilis'in biyofilm oluşturma yeteneği belirlendikten sonra biyofilm gelişimini araştırmak için kullanılan en yaygın model organizma olmuştur. B. subtilis hücrelerinin kemotaksis (kimyasala yönelim) veya hareketlilik (motilite) özelliklerini geliştirmeleri büyümenin logaritmik fazı sonunda hücrelerin çevreden aldığı besin yetersizliğine yönelik oluşturduğu sinyaller ile uyarılmaktadır. Besin yetersizliğinin büyüme evresinin durağan döneminde de devam etmesi durumunda B. subtilis hücreleri, hücre dışı ortama alternatif besin kaynaklarını parçalayacak ve kendilerine çevrede üstünlük sağlayacak ikincil metabolitler (proteaz ve antibiyotik) üretirler. Büyümenin durağan evresinin daha ileri fazlarında, B. subtilis hücreleri kompetans geliştirip ortamdan ölen hücrelerin DNA parçalarını almaya başlar ve genetik çeşitliliğini arttırır. Son olarak ise çevresel değişimlere karşı B. subtilis hücrelerinin geliştirdiği kemotaksis, hareketlilik, ikincil metabolit üretme ve kompetans geliştirme gibi yanıtların yetersiz kaldığı durumda, hücreler spor oluşturarak çevresel koşullar tekrar elverişli olana kadar spor formunda varlığını sürdürmeye devam eder. Bir biyofilm yapısı, hücrelere hayatta kalmak için optimum çevresel koşullar sağlayan hidratlı ve polisakkarit esaslı bir biyofilm matrisini ve sistematik olarak düzenlenmiş mikro kolonileri içerir. B. subtilis, izojenik popülasyonun özelleşmiş hücre tiplerine farklılaşması ve biyofilm matrisini oluşturan ortak makromoleküllerin üretimi ile kooperatif bir topluluk olarak işlev görür. B. subtilis NCIB 3610 yaban suşu kompleks yapılı damar benzeri görünüme sahip kalın biyofilm yapıları oluştururken, PY79 gibi evcileştirilmiş laboratuvar suşları ince, zayıflatılmış, kırılgan bir yapıya sahip hücre toplulukları oluşturmaktadır. Biyofilm oluşumu, bazı dış sinyallere cevap olarak matris genlerinin ifadesiyle başlar ve B. subtilis'in olgun bir biyofilminde, hücre dışı matris sentezleyen hücreler, hareketli hücreler ve sporlara dönüşen hücreler olmak üzere farklı alt topluluklar vardır. Biyofilm gelişimi, yüzeye ilk temas, tersinir bağlanma, tersinmez bağlanma ile biyofilm olgunlaşması ve dağılması aşamaları olmak üzere dört basamakta gerçekleşir. Biyofilm gelişimi sürecinde bu farklı hücre tiplerinin oluşumu ve katılımının hücre-hücre iletişimi yoluyla farklı hücre tiplerinin fizyolojilerini koordine etmesiyle sağlanmaktadır. Çeşitli hücresel farklılaşma programlarını tetikleyen spesifik sinyal moleküllerinin üretilmesi ve salgılanması ile bakterilerde hücre-hücre iletişimi sağlanır. B. subtilis'de“Quorum sensing”sistemi içerisinde ComX ve sürfaktin sinyal molekülleri hücre-hücre iletişim ağında yer alır ve parakrin sinyal molekülü olan sürfaktin biyofilm oluşturan matris üretici hücre farklılaşmasını tetiklemektedir. Basilisin biyosentezinin regülasyon mekanizmasının anlaşılması amacı ile araştırma grubumuzca yürütülen bir çalışmada, sürfaktin biyosentezinden sorumlu peptid sentetazı kodlayan biyosentetik srfA operonunun inaktive edilmesi ile basilisin biyosentezinin durduğu tespit edilmiştir. Sürfaktin biyosentezinde olduğu gibi, basilisin biyosentezi de B. subtilis“quorum sensing”molekülü ComX' e yanıt olarak tetiklenmektedir. Bu ortak bulgular, sürfaktin gibi basilisinin de biyofilm gelişim ve olgunlaşma sürecinde, hücrelerin fizyolojik değişimini kontrol eden farklı hücre tiplerinin oluşması ve korunmasında görev yapan önemli bir sinyal molekülü olarak sürfaktin ile birlikte çalışabileceğine ve sürfaktin biyosentezi ile yakın ilişkide olabileceğine kuvvetle işaret etmektedir. Bu bulgular ışığığında, bu projede basilisin biyosentezi ve surfaktin biyosentezi arasında olası ilişkinin aydınlatılması amaçlanmış ve Bacillus subtilis'de basilisin yokluğunda sürfaktin üretiminin nasıl etkilendiği araştırılmıştır. Proje kapsamında ilk olarak, 3610 suşunda, bacABCDEF basilisin biyosentez operon bölgesi insersiyonel pMutinT3 vektörünün Bacillus subtilis'in kromozomal DNA'sına homolog rekombinasyonla entegre olmasıyla bloke edilmiş, DE1 (bacA::lacZ::erm) suşu oluşturulmuştur. Ardından sürfaktin üreten hücrelerin floresan mikroplaka okuyucu ile gen ekspresyon miktar analizine olanak sağlamak için sürfaktin biyosentezinden sorumlu srfA operonunun promoter (PsrfA) bölgesi ile kırmızı floresan proteinini (RFP) kodlayan açık okuma bölgesi birleştirilerek transkripsiyonel bir füzyon vektörü oluşturulmuştur. Ardından bu transkripsiyonel füzyon vektörü, 3610, PY79, DE1 ve bac operon bloke PY79 suşu OGU1(bacA:: lacZ::erm) suşlarına transforme edilerek, sırasıyla 3610-RS (amyE::PsrfA::rfp CmR); PY79-RS (amyE::PsrfA::rfp CmR); DE1-RS (bacA::lacZ::erm amyE::PsrfA::rfp CmR) and OGU1-RS (bacA::lacZ::erm amyE::PsrfA::rfp CmR) suşları elde edilmiştir. Sürfaktin üretme besiyeri olan Landy sıvı kültürde 72 saate kadar büyütülen tüm bu suşlardan, belirli saatlerde örnekler toplanıp, floresan mikroplaka okuyucu ile gen ekspresyon miktarını belirlemek için kullanılana kadar -20°C'de saklanmıştır. Suşların büyüme eğrileri, belirli zaman aralıklarında Landy kültüründen alınan hücre kültürünün OD600 değeri ölçülerek belirlenmiştir. PsrfA-yönelimli kırmızı floresan, CLARIOstar mikroplaka okuyucu (430-0667) kullanılarak izlenmiştir. Ardından, PY79 ile kıyasla 3610 suşunda basilisin biyosentez operonunun ekspresyon seviyesi belirlenmiştir. Son olarak, B. subtilis de basilisin biyosentezi ve sürfaktin biyosentezi arasında var olabileceği düşünülen ilişki hakkında daha ileri veri elde etmek amacı ile DE1 suşunun, B. subtilis de sürfaktinin dahil olduğu prosesler olarak bilinen, yayılma motilitesi ve biyofilm geliştirme davranışları yabanıl suş 3610 ile karşılaştırmalı olarak incelenmiştir.

Özet (Çeviri)

Bacillus subtilis is a non-pathogenic, rod-shaped, aerobic Gram positive soil bacterium that can form endospores. The entire genome of Bacillus subtilis is sequenced and has 4,214,810 base pairs (bp) with 4,100 protein coding regions. Initially, Gram-negative bacteria were used to investigate the basic mechanisms of biofilm formation, but Bacillus subtilis has been the most common model organism used to investigate biofilm development after determining its robust biofilm formation ability. In a mature biofilm of B. subtilis, there are different sub-communities such as extracellular matrix producing cells, motile cells and spore forming cells. In the biofilm development process, the formation and participation of these different cell types is ensured by coordinating the physiology of different cell types through cell-cell communication. Cell-cell communication, or quorum sensing, is provided in bacteria by producing and secreting specific signal molecules that trigger various cellular differentiation programs. In B. subtilis, ComX and surfactin signal molecules involve in the cell-cell communication network, and surfactin which is a paracrine signaling molecule, triggers the biofilm-forming matrix cell differentiation. In a study conducted by our research group to understand the regulation mechanism of bacilysin biosynthesis, it was found that the bacilysin biosynthesis is inhibited by inactivating the biosynthetic srfA operon encoding the peptide synthetase responsible for surfactin biosynthesis. As with surfactin biosynthesis, bacilysin biosynthesis is triggered in response to the B. subtilis“quorum sensing”molecule ComX. These common findings strongly suggest that bacilysin might work with surfactin as a signaling molecule that plays a role in the formation and maintenance of different cell types that control the physiological change of cells in the biofilm development and bacilysin biosynthesis may also be in a closely related with surfactin biosynthesis. According to these findings, in this study it was aimed to investigate the effect of bacilysin biosynthesis on the expression of surfactin biosynthesis operon in B. subtilis domesticated strain PY79 and undomesticated strain NCIB 3610. For this purpose, in 3610 strain, bacABCDEF bacilysin biosynthetic operon was first disrupted by the integration of the pMutinT3 vector via homologous recombination into the bacA gene on the genome of B. subtilis thereby obtaining bac operon deficient 3610-derived strain DE1(bacA::lacZ::erm). PsrfA-rfp transcriptional fusion vector was then constructed by combining the promoter region of the srfA operon (PsrfA) responsible for surfactin biosynthesis and the open reading region encoding the red fluorescent protein (RFP) to allow gene expression quantification with the fluorescent microplate reader. After that, PsrfA-rfp transcriptional fusion vector was transformed in to 3610, PY79, DE1 and bac operon deficient PY79-derived strain OGU1 (bacA::lacZ::erm), to generate 3610-RS (amyE::PsrfA::rfp CmR); PY79-RS (amyE::PsrfA::rfp CmR); DE1-RS (bacA::lacZ::erm amyE::PsrfA::rfp CmR) and OGU1-RS (bacA::lacZ::erm amyE::PsrfA::rfp CmR) strains, respectively. All these strains were grown in surfactin production medium, Landy medium, for 72 hours, and at certain time intervals, 1 ml of sample was collected, and stored at -20°C for further fluorescence microplate assay to investigate the gene expression level of srfA operon promoter. Growth profiles of these strains in Landy medium were characterized by measuring the OD600 value of the cell culture taken from Landy medium and srfA-directed red fluorescent was monitored using the CLARIOstar microplate reader (430-0667). Moreover, expression of bacABCDEF operon in 3610 compared to PY79 was also determined. Finally, swarming motility and robust biofilm development in B. subtilis require surfactin signal molecule. Therefore these functions of DE1 strain were also characterized comparing with its parental strain 3610 to obtain further evidence about the relationships between the bacilysin and surfactin biosynthesis.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    292121

    Characterization of the yvfI mutant spores

    yvfI mutant sporlarının karakterizasyonu

    EZGİ ARSLAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2010

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. AYTEN YAZGAN KARATAŞ

  2. Tez No

    862376

    Akut koroner sendromda immün kontrol noktası proteinleri ile Th1/Th2 hücre sitokinleri arası moleküler ilişki

    Molecular relationship between immune control point proteins and Th1/Th2 cell cytokines in acute coronary syndrome

    ULAANKHUU BATGEREL

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    Allerji ve İmmünolojiİstanbul Üniversitesi

    İmmünoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. GAYE ERTEN YURDAGÜL

  3. Tez No

    260903

    IVF tedavisi sonrası implantasyon başarısızlığı olan olgularda endometrial Igf2 ve H19 gen ekspresyonlarının fertil grupla karşılaştırılması

    Comparison of endometrial Igf2 ve H19 gene expressions in fertile groups and patients with implantational failure succeeding IVF treatment

    AYDAN ASYALI BİRİ

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2010

    Kadın Hastalıkları ve DoğumGazi Üniversitesi

    Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. SEVDA MENEVŞE

  4. Tez No

    536679

    Kalp yetmezlikli köpeklerde hemostazisin değerlendirilmesine yeni bir yaklaşım: Platelet proteomik profili

    A new approach to the evaluation of hemostasis in dogs with heart failure: platelet proteomic profile

    PINAR LEVENT

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    Veteriner HekimliğiBursa Uludağ Üniversitesi

    İç Hastalıkları (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEKİ YILMAZ

  5. Tez No

    859384

    Nöropeptid w (NPW)'nin pankreas kanseri hücre hatlarında nöral invazyon ve proliferasyondaki rolünün aydınlatılması

    Elucidating the role of neuropeptide w (NPW) in neural invasion and proliferation of pancreatic cancer cell lines

    RABİA RÜMEYSA ÖRNEK

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    FizyolojiAcıbadem Mehmet Ali Aydınlar Üniversitesi

    Fizyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. HANDE YAPIŞLAR

    DR. ELİF SEVER

Geri Dön