Geri Dön

The relationship between urinary exosomal miRNA levels and renal outcome in type 2 diabetic nephropathy patients

Tip 2 diyabetik nefropati hastalarında üriner eksozomal miRNA düzeylerinin renal outcome ile ilişkisi

PDF İndir

  1. Tez No: 676190
  2. Yazar: MEHMET SEYİT ZOR
  3. Danışmanlar: PROF. DR. EDA TAHİR TURANLI
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Genetik, Moleküler Tıp, Genetics, Molecular Medicine
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2021
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 60

Özet

Diyabetik Nefropati (DN), diyabetik hastaların% 40'ından fazlasını etkileyen, en sık karşılaşılan mikrovasküler komplikasyonlardan biridir. Aynı zamanda böbrek yetmezliğinin, son dönem böbrek hastalığının (ESRD) ana nedenlerinden biridir ve diyalizden böbrek nakline kadar değişen tedaviler gerektirir. Diyabetik nefropati, mezanjiyal hücre proliferasyonu, podosit bozulması, hücre dışı matriks (ECM) birikimi veya glomerüler membran kalınlaşması ile karakterize edilir. Başka bir kronik böbrek hastalığı olan Fokal Segmental Glomerüloskleroz (FSGS) da benzer şekilde böbrek yetmezliğinin temel nedenlerinden biridir. Genellikle tübüler atrofi, glomerüler skleroz, podosit bozulması ve interstisyel fibroz ile karakterize, yaygın bir glomerüler hastalıktır. Kronik böbrek hastalıkları (KBH) genellikle erken evrelerde herhangi bir belirti göstermez. Genellikle belirtiler böbrek fonksiyonunun kaybına bağlı olarak ortaya çıkar. Çoğu kronik böbrek hastalığında semptomlar belirsiz olabilir ve ayrıcı olmayabilir, dolayısıyla pek çok vakada hastalığın altta yatan nedeni saptamak için biyopsi gibi invaziv testlere ihtiyaç duyulur. Bu nedenle, böbrek patolojisinin ayırıcı tanısı, böbrek bozukluklarının (KD) erken teşhisi ve hastalığın klinik olarak izlenmesinde hayati öneme sahiptir. İdrar albümini, üre nitrojen (BUN) seviyeleri ve veya serumda kreatin seviyeleri böbrek hasarının göstergeleri olarak kullanılmaktadır, ancak kesin tanı için genellikle kanama ve enfeksiyonlar gibi ciddi komplikasyonlara yol açabilen oldukça invaziv bir yöntem olan böbrek biyopsisine ihtiyaç duyulmaktadır. Böbreğin rejeneratif olmayan bir organ olması sebebiyle böbrek patolojisinin tipini daha güvenli bir şekilde tanımlamak için noninvazif tanı yöntemlerinin geliştirilmesi gereklidir. MikroRNA'lar (miRNA'lar) kısa, 18-22 nükleotid uzunluğunda kodlanmayan ve tek sarmallı RNA molekülleridir. Neredeyse her dokuda çeşitli yolaklarda mRNA hedeflerine bağlanarak gen ekspresyonunun transkripsiyon sonrası düzenleyicileri olarak görev yaparlar. miRNA'lar, keşfi halen devam etmekte olan moleküllerdir. miRBase veritabanının en son sürümü (22.1) insanlarda 2654 olgun miRNA veri içermektedir. Hücre farklılaşması, büyümesi, çoğalması ve apoptoz gibi çeşitli mekanizmalarda aktif rol oynadıkları bilinmektedir, ayrıca miRNA'ların çeşitli hastalıkların patofizyolojisinde rol oynadığı da tespit edilmiştir. Olgun (mature) miRNA'lar, mRNA'yı hedefleyen transkripsiyon sonrası düzenleyiciler olarak işlev görür ve iki RNase III tipi proteinin (çekirdekte Drosha ve sitoplazmada Dicer) etkisiyle birincil miRNA'lardan (pri-miRNA'lar) iki adımda sentezlenirler. Çekirdekte sentezlenen çift sarmallı pre-miRNA'ların Argonaute proteinlerinden oluşan RNA-derived silencing complex (RISC) ile birlikte Dicer'a bağlanmasıyla beraber pre-miRNA formu tek sarmallı olgun forma dönüşür. MiRBase veritabanının en son sürümü (22.1), insanlarda bilinen 2654 olgun miRNA verisi içermektedir. İdrar gibi vücut sıvılarındaki miRNA'lar, genellikle eksozomal formda, kapsüllenmiş olarak bulunur. Eksozomlar hücrelerden salgılanan proteinleri, lipitleri, metabolitleri veya RNA gibi nükleik asitleri içeren veziküllerdir. Eksozomlarda bulunmaları dolayısıyla üriner miRNA'ların serbest olanlara kıyasla daha stabil olduğu düşünülmektedir. Bu nedenle üriner eksozomlar çeşitli hastalıklarda biyobelirteç olarak kullanılabilecek miRNA'ları barındıran ideal taşıyıcılardır. Çeşitli çalışmalar, akut böbrek hasarı (AKI) ve CKD gibi bbörek hastalıklarının tanısında biyobelirteç olarak miRNA'ların önemini vurgulamaktadır. Çeşitli böbrek rahatsızlığı olan hastalardan alınan idrar örneklerinde ölçülen miRNA düzeyleri hastalık gruplarında farklılık göstermektedir. Bu nedenle idrarda bulunan moleküllerin biyobelirteç olarak araştırılması zaman içinde önem kazanmıştır. miRNA'ların artan önemi göz önüne alındığında, gerçek zamanlı kantitatif PCR gibi yöntemler miRNA ekspresyon analizinde öne çıkmaktadır. miRNA'nın kısa boyutları nedeniyle, geleneksel ve universal primerler yerine, özellikle olgun miRNA'ya bağlanan stem-loop oligonükleotidleri geliştirilmiştir. Ayrıca TaqMan gibi probların geliştirilmesi örnekteki miRNA seviyelerinin yüksek kesinlikte belirlenmesini mümkün kılmıştır. miRNA'ların gen regülasyonundaki rolü ve hastalık gelişimi üzerindeki etkileri günümüzde geniş çapta incelenmektedir. miRNA seviyelerinin çeşitli hastalıklarda farklılık gösterdiği bulunmuştur. Örneğin FSGS'den etkilenen böbreklerde miR-193a ekspresyonu sağlıklı kontrol grubuna göre daha yüksek bulunmuştur. Yakın zamanda yapılan bir diğer çalışmada diyabetik böbrek rahatsızlığı fare modellerinde miR-21 ekspresyonunun arttığı gösterilmiştir. Günümüzde birçok miRNA aktif olarak araştırılmaktadır. Bu çalışmada, diğer çalışmalarda ele alınan miRNA'ları değerlendirdik. Böbrek hücresi gelişiminde aktif bir rol oynadığı görülen miRNA'ları potansiyel biyolojik belirteçler olarak inceledik. Bu anlamda çalışmaya böbrek dokusundaki biyolojik rolleri birçok çalışmada incelenen ve KBH gelişiminde aktif rol oynadığı düşünülen 5 miRNA (mir-21, mir-30, mir-200, mir-193, mir-196) dahil edilmiştir. Bu miRNA'ların, podosit oluşumu gibi böbrekteki hücresel mekanizmaları düzenlediği bilinmektedir. FSGS ve DN hastalarının ayırıcı veya erken teşhisinde biyobelirteç olarak bu miRNA'ların idrar seviyelerini araştırdık. Bu çalışmaya Tip II Diyabet tanısı almış 13 hasta, Fokal Segmental Glomerüloskleroz tanısı almış 11 hasta ve 13 sağlıklı kontrol dahil edilmiştir. Hedeflenen miRNA'ların izolasyonu, üriner eksozomlardan gerçekleştirilmiştir ve izole edilmiş miRNA'ların kantitatif profili qPCR ile ölçülmüştür. Ayrıca U6, idrar miRNA analizinde referans gen olarak kullanılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre hasta gruplarında sağlıklı kontrol gruplarına göre hsa-mir-196a ve hsa-mir-200a düzeylerinin artmış olduğu görülmüştür. (mir-200a: FSGS: 1.301, DN: 1.909, mir-196a: FSGS: 2.47, DN: 1.278). FSGS grubunda hsa-mir-193a seviyeleri yukarı regüle edilirken, DN grubunda önemli bir farklılık gözlenmemiştir (DN: 1.017, FSGS: 4.18). hsa-mir-21 ve hsa-mir-30a seviyelerinin FSGS grubunda artmış olduğunu ancak DN grubunda azalmış olduğu görülmüştür. (mir 21: FSGS: 2.267, DN: 0.668, mir-30a: FSGS: 1.378, DN: 0,874). FSGS grubundaki artan mir-193a seviyesi önceki bulguları desteklemektediri ancak miR-193a'nın DN grubunda ölçülen miRNA seviyesinde önemli bir değişim görülmemiştir bu nedenle hastalığın gelişiminde rol oynadığını veya belirteç olarak kullanılabileceğini söylemek mümkün değildir. Geçmiş çalışmalarda düşük miR-196a seviyeleri, TGFbR2 miktarının artması ve renal fibrozun inhibe edilmesiyle ilişkilendirilmiştir. İdrar miR-196a'daki artışın, pasif renal miR-196a'nın hasarlı böbrek hücrelerinden idrara sızmasına bağlı olduğu düşünülmektedir. TGF-β-Smad sinyal yollarının miR-21 ve miR-200a seviyeleri ile ilişkili olduğu bilinmektedir. Bulgularımızda mir-21 seviyeleri FSGS gruplarında artarken DN gruplarında azalmıştır. Öte yandan mir-200a DN grubunda FSGS grubuna göre daha yüksek bir artış göstermektedir. Renal hipertrofinin yapılan çalışmalarda, Akt aktivasyonunu artıran yüksek glikoz ile uyarılan miR-21 ekspresyonuna bağlı olduğu gösterilmiştir. DN grubundaki düşük mir-21 seviyeleri, diyabet nedeniyle hastaların sahip olduğu düşük glikoz değeri ile ilişkili olabilir. Ancak, bu görüşün daha ileri çalışmalarda incelenmesi gerekmektedir. miR-30 ailesinin podositlerde güçlü bir şekilde ifade edildiğini ve seviyelerinin hastalık durumuna göre değişimi yapılan çalışmalarda ifade edilmiştir. Bu durum FSGS grubundaki artan seviyeleri açıklayabilir. Ancak öte yandan, podositlerdeki miR-30a, NFATc3'ün nükleer translokasyonunu düzenleyerek hücre iskeletinin stabilitesini korumaktadır. Bu, miR-30a seviyelerinin azaltılmasının NFATc3'ün koruyucu etkisini azalttığını gösterir. DN grubunda azalan mir-30a seviyeleri bu bulguları desteklemektedir. Bununla birlikte, FSGS ve DN grupları arasındaki farklılıkları açıklamak için ile çalışmalara ihtiyaç vardır. miRNA'lar, farklı dokularda ve çeşitli şartlarda hücresel mekanizmalarda rol oynamaktadır. Birden fazla gen, birden fazla miRNA tarafından hedeflenebilmekte ve aynı yolakta rol oynayabilmektedir. Bu nedenle miRNA'ları, mRNA'ları ve diğer faktörleri birbirinden bağımsız olarak değerlendirmek hatalı sonuçlara yol açacaktır. Mevcut çalışmalar, karmaşık mekanizmaları anlamak için yetersiz kalan belirli miRNA'ları incelemektedir. Vücut sıvılarındaki miRNA düzeylerinin belirlenmesi pek çok kritere bağlı hassas bir süreçtir. Bugün, çeşitli araştırmalarda biyobelirteç adayı olarak tanımlanan miRNA'lar yeterli spesifikliğe sahip değildir ve ekspresyonlarının çok çeşitli koşullara bağlı olduğu gösterilmiştir. Aynı hastalığa ait özdeş araştırmalarda dahi sonuçların örtüşmediği gösterilmiştir. miRNA'lar, non-invaziv testlerde biyolojik belirteçler olarak kullanılma potansiyeline sahip moleküllerdir, ancak mevcut bilgilerimiz miRNA'ların klinik uygulamada pratik kullanımını sağlamaktan uzaktır.

Özet (Çeviri)

Diabetic nephropathy (DN) is one of the most commonly encountered microvascular complications, affecting more than 40% of diabetic patients. It is also one of the main causes of kidney failure, end-stage renal disease (ESRD) and requires treatments ranging from dialysis to kidney transplantation. Diabetic nephropathy is characterized by mesangial cell proliferation, podocyte disruption, extracellular matrix (ECM) deposition, or glomerular membrane thickening. Focal segmental glomerulosclerosis (FSGS), another chronic kidney disease, is likewise one of the main causes of kidney failure, ESRD. It is a common glomerular disease generally characterized by tubular atrophy, glomerular sclerosis, podocyte disruption and interstitial fibrosis. Chronic kidney diseases (CKD) usually do not present any symptoms in the early stages. The first symptom arises due to the loss of kidney function. Also symptoms in most CKD can be ambiguous and may not be discriminatory, and examinations such as biopsy are needed to detect the leading cause in most cases. Therefore, differential diagnosis of kidney pathology and early diagnosis of kidney disorders (KD) is vital in clinical monitoring of the progression of the disease and also essential for higher rates of recovery. Levels of urine albumin, urea nitrogen (BUN) and creatine levels in serum or proteinuria may be indicators of kidney damage but for definitive diagnosis usually relies on a kidney biopsy which is a highly invasive method that may lead to dire complications such as bleeding and infections. As the kidney is a non-regenerative organ, development of non-invasive diagnostic methods is necessary for defining the type of renal pathology more safely. MicroRNAs (miRNAs) are small, 18–22 nucleotides long non-coding and single-stranded RNA molecules. They are known as post-transcriptional regulators of gene expression by binding to their mRNA targets in various pathways in almost every tissue. miRNAs are molecules whose discovery has been continuing over the past few decades. They are known to play an active role in various mechanisms such as cell differentiation, growth, proliferation and apoptosis. It has been established that miRNAs play a role in the pathophysiology of various diseases. Mature miRNAs act as post-transcriptional regulators, targeting mRNA and they are formed in two steps from primary miRNAs (pri-miRNAs) by the action of two RNase III type proteins (Drosha in the nucleus and Dicer in the cytoplasm). Binding of the double-stranded pre-miRNAs that are synthesized in the nucleus to the Dicer along with RNA-derived silencing complex (RISC) which is comprised of Argonaute proteins lead to processing of pre-miRNA into the single-stranded mature form. Mature miRNAs act as post-transcriptional regulators, targeting mRNAs. The latest version (22.1) of the miRBase database contains 2654 mature miRNA data in humans. miRNAs in bodily fluids such as urine are usually encapsulated in exosomal form. Exosomes are lipid bilayer vesicles that contain proteins, lipids, metabolites or nucleic acids such as RNA secreted from cells. As urinary miRNAs are contained within these vesicles, they are less prone to degradation and therefore more stable than freely circulating miRNAs. As a result, urinary exosomes are ideal carriers containing miRNAs that can be used as biomarkers in diagnosis of various diseases. Several studies show variance in both the amount and type of miRNAs that are excreted in the urine samples obtained from patients with a variety of kidney conditions which emphasizes the importance of miRNAs as biomarkers in diagnosis of KDs such as acute kidney injury (AKI) and CKD. Given the increasing importance of miRNAs, methods like real-time quantitative PCR have been extended to miRNA expression analysis. Because of miRNA's short sizes, instead of traditional and universal primers, stem-loop oligonucleotides that bind specifically to a mature miRNA are developed. The miRNA molecules are reverse transcribed into cDNA with these oligonucleotides by polymerase chain reaction, this process followed by quantitative analysis with another pair of oligonucleotides and TaqMan probes to determine fluorescence in qPCR that is used to determine miRNA levels in a sample. With emerging technologies, miRNA studies have also accelerated. The role of miRNAs in gene regulation and their effects on disease development are widely studied today. It has been shown that miRNA levels differ in various diseases. In FSGS-affected kidneys, miR-193a expression found higher than in healthy kidneys. In a recent study miR-21 was identified by global miRNA expression profiling as one of the main miRNAs upregulated in the kidneys of diabetic mice and patients with DN. Today, due to their large numbers, many miRNAs are actively being researched. In this study, we evaluated the miRNAs from the studies according to the amount of evidence found about them. We evaluated also miRNAs, which seem to play an active role in kidney cell development, as potential biomarkers. 5 miRNAs (mir-21, mir-30, mir-200, mir-193, mir-196) whose biological roles in kidney tissue have been examined in multiple studies and known to play an active role in the development of CKDs are selected. These miRNAs known to regulate cellular mechanisms in the kidney, like podocyte formation. We investigated the urinary levels of these miRNAs as biomarkers in the differential or early diagnosis of FSGS and DN patients. 13 patients diagnosed with Type II Diabetes, 11 patients diagnosed with Focal Segmental Glomerulosclerosis and 13 healthy controls were included in this study. Isolation of targeted miRNAs was performed from urinary exosomes, and then the quantitative profile of the isolated miRNAs was measured by qPCR. In addition, U6 is used as a housekeeping gene in urinary miRNA analysis. In this study we found hsa-mir-196a, and hsa-mir-200a levels were upregulated in the patient groups compared to the healthy control groups. (mir-200a: FSGS: 1.301, DN: 1.909, mir-196a: FSGS: 2.47, DN: 1.278). While hsa-mir-193a levels were highly upregulated in the FSGS group, no significant dysregulation in the DN group observed (DN: 1.017, FSGS: 4.18). The hsa-mir-21 and hsa-mir-30a levels were upregulated in the FSGS group but downregulated in DN group compared to the control group (mir-21: FSGS: 2.267, DN:0.668, mir-30a: FSGS: 1.378, DN: 0.874). The increased level of mir-193a in the FSGS group supports previous findings. It is not possible to indicate that miR-193a plays a role in the development of the disease in the DN group, since the fold change levels did not show a significant change. Low levels of miR-196 have been linked to increasing the amount of TGFbR2 and inhibiting renal fibrosis. The rise in urinary miR-196a may be thought to be due to passive renal miR-196a leakage into urine from damaged renal cells. TGF-β-Smad signaling pathways are thought to be associated with miR-21 and miR-200a levels. In our findings, while mir-21 levels increased in the FSGS groups, they decreased in the DN groups. On the other hand, our mir-200a findings indicated a higher increase in the DN group compared to the FSGS group. The DN group, on the other hand, did not show this increase. Renal hypertrophy can be linked to high glucose-stimulated miR-21 expression, which enhances Akt activation. The low levels of mir-21 in the DN group may be related to the low glucose value of patients due to diabetes. However, this needs to be examined in further studies. Previous studies have shown that the miR-30 family is strongly expressed in podocytes and that its levels vary with disease state. This could explain the increased levels in the FSGS group. But as an opposite finding, the miR-30a levels in podocytes regulate the nuclear translocation of NFATc3 to protect cytoskeleton rearrangements. This indicates that decreasing miR-30a levels reduces the protective effect of NFATc3. The decreased mir-30a levels in the DN group support these findings. However, further studies are needed to explain the differences between FSGS and DN groups. miRNAs play a role in cellular mechanisms in different tissues and different states. Multiple genes are targeted by more than one miRNA and can play a role in the same pathway. Therefore, evaluating miRNAs, mRNAs and other factors independently from each other will lead to erroneous results. Current studies monitor specific miRNAs which are insufficient to understand complex mechanisms. The accurate quantification of circulating miRNAs proved to be more difficult and challenging. The most commonly identified miRNAs as biomarkers are nonspecific, indicating they are linked to a wide variety of conditions and outcomes. Even very identical research of the same disease has shown no overlap in their results. miRNAs are molecules that have the potential to be used as biomarkers in non-invasive tests, but our current knowledge is far from providing the practical use of miRNAs in clinical practice.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    870183

    Kadınlarda üriner inkontinans sıklığı, şiddeti ve yaşam kalitesi arasındaki ilişki

    The relationship between urinary incontinence frequency, severity, and quality of life in women

    FİRDEVS GAYDAN

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    Aile HekimliğiOndokuz Mayıs Üniversitesi

    Aile Hekimliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MUSTAFA FEVZİ DİKİCİ

  2. Tez No

    60020

    Tip 2 diabetlilerde idrar amilaz izoenzimleri ve lösin aminopeptidaz aktivitelerinin klinik retinopati ile ilişkisi

    The Relationship between urinary activities of amylase isoenzymes and leucine aminopeptidase and clinical retinopathy in type 2 DM

    MUSTAFA ŞAHİN

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    1997

    Göz HastalıklarıOndokuz Mayıs Üniversitesi

    Göz Hastalıkları Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. İHSAN ÖGE

  3. Tez No

    419958

    Postmenopozal dönem kadınlarda bel çevresi genişliği ve fiziksel aktivite düzeyinin üriner inkontinans ile ilişkisi

    The relationship between urinary incontinence, waist circumference and physical activity level of postmenopausal women

    ESMA NUR KALAFAT

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2016

    Fizyoterapi ve Rehabilitasyonİstanbul Medipol Üniversitesi

    Fizyoterapi ve Rehabilitasyon Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. ESRA ATILGAN

  4. Tez No

    910142

    Tip 2 diyabetes mellituslu hastalarda üriner inkontinans ve sarkopeni ilişkisi-tek merkezli çalışma

    The relationship between urinary incontinence and sarcopenia in patients with type 2 diabetes mellitus - a single centre study

    HATİCE CAN

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    Aile Hekimliğiİstanbul Medeniyet Üniversitesi

    Aile Hekimliği Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. HACER HİCRAN MUTLU

  5. Tez No

    447255

    Çalışan kadınlarda yaşam kalitesinin belirlenmesi ve üriner inkontinans görülme sıklığının değerlendirilmesi

    Determination of quality of life and evaluation of the frequency of urinary incontinence in working women

    GİZEM BOZTAŞ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2016

    Fizyoterapi ve Rehabilitasyonİstanbul Medipol Üniversitesi

    Fizyoterapi ve Rehabilitasyon Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZELİHA CANDAN ALGUN

Geri Dön