Molecular genetics of cryii-and-crystal protein synthesis in bacillus thuringiensis 8 and cloning of cryi a (c) gene in e.coli
Bacillus thuringiensis 81'de CRY I ve CRY II kristal protein sentezinin molekülar genetiği ve CRY IA (c) geninin E.Colide klonlanması
- Tez No: 68331
- Danışmanlar: PROF. DR. N. G. ALAEDDİNOĞLU
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Delta-endotoksin, Bacillus thuringiensis, Bioinsektisid, Kristal protein, crylA geni vııı, Delta-endotoxin, crystal protein, Bacillus thuringiensis, Bioinsecticide clones, cry I genes
- Yıl: 1997
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 140
Özet
ÖZ BACILLUS THURINGIENSISZV DE CRYI VE CRYII KRİSTAL PROTEIN SENTEZİNİN MOLEKÜLAR GENETİĞİ VE CRYIA(C) GENİNİN E. COLI'DE KLONLANMASI Afkhami, Parvaneh Doktora, Biyoloji Bölümü Tez Yöneticisi: Prof. Dr. N.Gürdal Alaeddinoğlu Yardımcı Tez Yöneticisi: Prof. Dr. Gülay Özcengiz Eylül 1997, 122 sayfa Bu araştırmada, crylA ve crylIA genlerinin, yerli bir izolat olan Bacillus thuringiensis 81 (B.t.81) deki yerleşimleri ve genetik ifadeleri araştırılmış ve bu susun taşıdığı crylA(c) geni E.colı DH5a' ya klonlanmıştır. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) deneyleri crylA(a) ve crylA(c) genlerinin B.t.%Y de bulunduklarını göstermiştir. PCR sonucu çoğaltılmış olan 467 bp lik crylA(c) geni parçası agaroz jelinden saflaştırıldıktan sonra pGEM- vıT vectoruna bağlanmıs ve elde edilen rekombınant plazmid E.coli DH5cc' da çoğaltılmıştır. PCR-cıylA fragmenti bu plazmidden geri kazanılarak digoxygenine (DIG) ile işaretlenmiş ve gerek genin yerleşiminin araştırıldığı Southern blot hibridizasiyon deneylerinde, gerekse de crylA geninin klonlanması aşamasında prob olarak kullanilmiştir. B.t.Sl de crylA geninin alt gruplarinin lokasyonunu PCR'in yanisira alternatif bir yöntemle araştirmak amaciyla BJ.8V in total DNAsi Hind III ile tamamen kesilmiştir. Southern blot hibridizasiyon deneyleri crylA(c) geninin B.t.%\ in pBT-2 (47.8 kb) plazmidi üzerinde olduğunu gösterilmiştir. Prob, beklendiği üzere, bu plazmidin yanisira B. t. 81 'in total DNA'sinin Hind III ile tamamen kesilmesiyle elde edilen fragmentlerden 6.6 kb büyüklüğünde olani ile hibridize olmuştur. crylIA geninin B.t.Sl susunda mevcut olup olmadigini tespit etmek amaci ile, crylIA geninin BamH I/Bgl II parçasi DIG ile işaretlenmiş ve Southern blot hibridizasyon deneylerinde prob olarak kullanılmıştır. Bu prob pBT-2 plazmidi ve ayrica total DNA' nin 5.0 kb lık Hind III parçasi ile hibridizasyon vermiştir. cryLA(c) genini B.tSV den iJ.c0//DH5a' ya klonlamak için, B.tSV in total DNAsı Hind III ile tamamen kesilmiş ve 4.5-7.0 kb arası büyüklüğe sahip DNA parçaları agaroz j elden safiaştırılmıştır. Bu DNA parçaları Hind III ile lineerize edilen pBluescript plazmid vektörüne bağlandıktan sonra, E.coli viiDH5a' ya aktarilmiştir. Rekombinantlar Ampicillin(Ap)/Isopropyl (3-D- Thiogalactopyranoside(IPTG)/5-bromo-4-chloro-3-indolyl-P-D-galactoside(X- gal)/LB agar plaklari üzerinde elde edilmişler, crylA(c) geni taşıyan rekombinantları seçmek için koloni blot hibridizasyonu kullanılmıştır. İncelenen 70 rekombinanttan 8' i cryIA(c) probu ile pozitif sinyal vermiştir. Bu kolonilerin plazmidleri Hind III ile kesildiklerinde biri vektör ve diğeri crylA(c) probu ile hibridizasyon veren 6.6 kb' lik iki DNA parçası ortaya çıkmıştır. crylA(c) probu ile hibridizasyon veren 8 koloni pPAcl-8 olarak adlandırılmıştır. E.coli DH5oc' ya klonlanmış olan cryIA(c) geninin ifade edilip edilmediğini araştırmak için rekombinant klon proteinleri izole edilmiş ve crylA(c) genini taşimayan E.coli DH5a proteinleri negatif kontrol olarak kullanılmak suretiyle SDS polyacrylamid jelinde kıyaslanmalardır. Beklenen 106 kDa luk proteinin rekombinant klonlardan hiç birisinde görülmemesi, bu genin rekombinant hücrelerde ifade edilmediğine veya SDS-PAGE yolu ile saptanamayacak miktarda az ifade edildiğine işaret etmiştir.
Özet (Çeviri)
ABSTRACT MOLECULAR GENETICS OF CRYI- AND CRYII-CRYSTAL PROTEIN SYNTHESIS IN BACILLUS THURINGIENSIS 81 AND CLONING OF CRYIA(C) GENE IN E.COLI Afkhami, Parvaneh Ph.D., Department of Biology Supervisor: Prof. Dr. N.G. Alaeddinoglu Co-supervisor: Prof. Dr. G. Özcengiz September 1997, 122 pages In this study the location and genetic expression of crylA and cryllA genes in Bacillus thrungiensis 81 (B.t. 81; a local isolate of Turkey) were investigated and crylA(c) gene harbored by this organism was cloned in E.coli DH5a. IllPolymerase Chain Reaction (PCR) experiments verified the presence of crylA(a) and crylA(c) genes in 5.^.81. PCR-amplified crylA(c) fragment (467 bp) was recovered from the agarose gel and after ligation to the pGEM-T vector, the recombinant plasmid was amplified in E.coli DH5a. The PCR- crylA fragment was next recovered from this plasmid, digoxygenine (DIG)- labeled and used as a probe in determination of gene location and further in cloning of crylA(c) gene. As an alternative strategy of investigating the presence of subclasses of crylA gene in B.t.Sl, the total DNA was completely digested with Hind III. Southern blot hybridization experiments implicated the presence of crylA(c) gene on the pBT-2 (47.8 kb plasmid) of B.t.81. The probe, as expected, was also hybridized to the 6.6 kb restriction fragment obtained through digestion of 5./.81 total DNA with Hind III. To identify the presence and location of the cryllA gene in B.t.8l, a BamH I/Bgl II fragment of cryllA gene was labelled with DIG and used as probe in Southern blot hybridization experiments. This probe was hybridized to the pBT-2 and also a ca. 5.0 kb Hind III fragment obtained by complete digestion of total DNA. For cloning of cry I A (c) gene from B.t.%\ in E.coli, total DNA of B.t. 81 was completely digested with Hind III and fragments with sizes ranging from 4.5 to 7.0 kb were recovered from the agarose gel. These fragments were IVligated to the Hind Ill-digested pBluescript vector and used to transform E.coli DH5a. Recombinants were detected on Ampicillin(Ap)/Isopropyl P-D- Thiogalactopyranoside(IPTG)/5-bromo-4-chloro-3-indolyl-P-D-galactoside(X- gal)/LB agar plates and the desired recombinants harboring crylA(c) gene were then screened by the use of colony blot hybridization technique. 8 out of 70 colonies screened, gave positive signal with the crylA(c) probe. Hind III digestion of plasmids isolated from the positive clones yielded two fragments, one in the size of the vector and the other 6.6 kb, giving hybridization when probed to DlG-crylA(c) fragment. The recombinant plasmids from 8 positive clones were assigned a number (pPAc 1 to 8, respectively). To determine if the cloned crylA(c) gene was expressed in E.coli DH5oc, proteins were extracted from the recombinant clones and compared to that of the cells which did not carry crylA(c) gene through sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). None of the clones revealed the presence of a recombinant protein with expected molecular mass of ca 1 06 kDa, indicating either lack of expression or very low level expression of the cloned gene that could not have been detected by SDS-PAGE.
Benzer Tezler
- Mısır içeren gıda ve yem çeşitlerinde genetiği değiştirilmiş organizmalarla ilgili genetik analizler
Genetically modified organisms related genetic analysis of maize derived food and feed
SİNAN MERİÇ
Yüksek Lisans
Türkçe
2012
Biyolojiİstanbul ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ŞULE ARI
- Molecular genetics of alzheimer's disease in the Turkish population
Alzheimer hastalığının Türk toplumunda moleküler genetiği
MEHMET BAKİ YOKEŞ
- Kalıtsal retina dejenerasyonlarının moleküler genetiği
Molecular genetics of inherited retinal degenerations
RIZA KÖKSAL ÖZGÜL
- Over kanserinde miR-200 ailesinin epitelyal-mezenkimal geçişdeki rolü
The role of the miR-200 family in epithelial-mesenchymal transition in ovarian cancer
MERVE ŞENTÜRK
Yüksek Lisans
Türkçe
2021
Genetikİstanbul ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. TUBA GÜNEL
- Tip 2 diabetes mellitus hastalarında pprag gen polimorfizminin araştırılması
Investigation of pparg gene polymorphism in patients with type 2diabetes mellitus
FEHİME DAĞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
GenetikHarran ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ARİF PARMAKSIZ
DR. ÖĞR. ÜYESİ ÖZLEM ÖZ
