Geri Dön

Inverse metabolic engineering of KCl-resistant Saccharomyces cerevisiae

Tersine metabolik mühendislik yöntemi ile KCl tuzuna dirençli Saccharomyces cerevisiae eldesi

PDF İndir

  1. Tez No: 737050
  2. Yazar: OGÜN MORKOÇ
  3. Danışmanlar: PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Mikrobiyoloji, Biotechnology, Microbiology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2022
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 89

Özet

Saccharomyces cerevisiae, tek hücreli, ökaryotik model bir organizmadır. Tomurcuklanan maya veya ekmek mayası olarak da bilinir. Yüksek ökaryotlar ile ortak birçok metabolik fonksiyona sahiptir. Bu nedenle yüksek ökaryotların karmaşık yapılarını anlamak için yararlı bir model organizmadır. Ayrıca S. cerevisiae, genomu dizilenen ilk ökaryotik organizmadır. S.cerevisiae'nın kültivasyonu kolay ve ucuzdur. -80℃'de gliserol içinde saklanabilir ve agar plakalarında büyütülüp saflaştırılabilir. Bunun yanısıra, gıda, şarap ve biyoyakıt endüstrileri dahil olmak üzere birçok biyoteknolojik uygulamanın temel taşıdır. S. cerevisiae'nin ozmotik, oksidatif, donma-erime, yüksek sıcaklık ve etanol stresi gibi çevresel stres faktörlerine karşı direnci, S. cerevisiae'yi biyoteknoloji için avantajlı kılmaktadır. KCl kokusu olmayan, beyaz bir metal tuzudur. Suda çözündüğünde K+ ve Cl- iyonlarına ayrışır. Potasyum iyonu, membran potansiyelinin dengelenmesi, enzim aktivasyonun sağlanması, ozmoregülasyon, pH regülasyonu ve protein translasyonu gibi çeşitli hücresel fonksiyonları sürdürmek için hayati bir öneme sahiptir. Sodyum (Na+) ve lityum (Li+) iyonlarının aksine, potasyum iyonu hücreler için toksik değildir. Normal hücresel fonksiyonlar için hücre içi K+ konsantrasyonun Na+ konsantrasyonundan yüksek olması gerekir. Hücresel K+/Na+ oranı yüksek olması membran potansiyelini dengeler ve diğer toksik katyonları hücre içerisine almak için gereken itici gücü azaltır. Hücre içi potasyum homeostazının regulasyonu, HOG, Calcineurin ve Rim yolları dahil olmak üzere karmaşık sinyal ağları tarafından kontrol edilir. K+'nın hücre içerisine alımına ve hücre dışarısına atılmasına membran üzerinde bulunan taşıyıcı (transporter) proteinler aracılık eder. K+ iyonlarını hücre içerisine alımından Trk1,2 membran proteinleri sorumludur. Tok1, Nha1 ve Ena1-5, 6 membran proteinleri ise K+ iyonun hücre dışına atımından sorumludur. Bunun yanı sıra, Nha1 ve Ena transporterları Na+ ve Li+ toksik iyonların hücre dışına atılmasından sorumludur. Membran üzerinde bulunan tüm transporter proteinleri membran potansiyelini korumak, turgor basıncını düzenlemek ve hücrelerin osmotik stres ile başa çıkabilmesi için koordineli olarak birlikte faaliyet gösterirler. Normal büyüme koşulları altında, S. cerevisiae'nin hücre içi K+ konsantrasyonu 200-300 mM civarındadır. Fakat hücre dışında, 400 mM'den fazla K+ bulunması hiperozmotik strese yol açar. Hiperozmotik strese maruz kalma, ani su kaybına ve hücre büzülmesine neden olur. Hücreler osmotik stresin etkilerinden korunabilmek için HOG sinyal yolağı tarafından kontrol edilen ozmotik stres tepki mekanizmalarını tetiklerler. Hiperozmotik strese karşı en etkili strateji, gliserol gibi ozmolitlerin hücre içindeki konsantrasyonunu arttırmaktır. Bu sayede hücreler, hücre içi çözünmüş madde miktarını arttırarak su kaybının önüne geçmiş olurlar. HOG yolunun aktivasyonu, stres yanıtı için 500'den fazla genin transkripsiyonunu düzenler. Bu çalışmada, KCl tuzu kaynaklı hiperosmotik strese dayanıklı S. cerevisiae suşları elde etmek için, tersine metabolik mühendislik yaklaşımı olan evrimsel mühendislik kullanılmıştır. Evrimsel mühendislik ile elde edilen suşların fizyolojik ve metabolik analizleri yapılmıştır. Evrimsel mühendislik için seçilim deneyi, kademeli olarak artan KCl stresi altında gerçekleştirilmiştir. Seçilim yapılmadan önce, S. cerevisiae referans (905) suşunun büyümesini inhibe eden minimum KCl stres konsantrasyonunu tayin edebilmek için tarama deneyi yapılmıştır. Tarama deneyi sonucunda 0.5 M KCl stresi, başlangıç stresi olarak belirlenmiştir. Stres seviyesi 22. popülasyona kadar her bir pasajda 0.05 M arttırılarak 1.5 M'a kadar çıkarılmıştır. Daha sonra artış miktarı 0.02 M'a düşürülerek stres seviyesi 2.5 M'a erişinceye kadar (72. populasyona kadar) seçilim devam ettirilmiştir. Son popülasyon (72) elde edildikten sonra, katı besiyerinde KCl stresi varlığında rastgele seçilen 12 koloni izole edilip, K1-K12 olarak adlandırılmıştır. Spot testi yapılarak, izole edilen suşların KCl stresine karşı direnç seviyeleri analiz edilmiştir. İzole edilen suşlar arasından K1, K9, K10, K11 ve K12 suşlarının 1.75 M KCl stresine daha dirençli oldukları gözlemlenmiştir. Yüzde hayatta kalma oranı hesaplamaları, 2 M KCl stresi varlığında K9 suşunun, referans (905) suşa kıyasla 1.9 kat daha fazla direnç gösterdiğini ortaya koymuştur. Akabinde, genetik stabilite testi yapılmış; K1, K9 ve K10 suşlarının genetik olarak kararlı oldukları tespit edilip, KCl'ye karşı dirençlerinin kalıcı olduğu gösterilmiştir. Genetik olarak kararlı olan K1, K9 ve K10 suşlarının fizyolojik karakterizasyonları ve çapraz direnç testleri, çeşitli stres türleri (0.7 M NaCl, 5 mM LiCl, 0.8 M CaCl2, 0.5 mM NiCl2, 7.5 mM AlCl3, 0.75 mM H2O2, %10 etanol, 15 mM kafein 1.5 M sorbitol, 1 M NH4CI, 15 mM MnCl2) ile yapılmıştır. K1 ve K10 suşları, birçok stres tipine karşı benzer davranış göstermiştir: Her ikisi de NaCl, H2O2 ve hafif düzeyde LiCl'ye karşı direnç kazanmıştır. Ancak K9 suşu NaCl, H2O2, LiCl, AlCl3 ve kafeine karşı hassasiyet göstermiştir. Bu kimyasalların dışında, katyonik ilaçlara (0.5, 0.8 ve 1 M TMA, 1.2, 2 ve 5 mM Spermine, 125 μg/mL Higromisin B) karşı direnç seviyeleri de test edilmiştir. Bahsi geçen toksik katyonlara karşı gösterilen tolerans, membran potansiyelinde bir azalmaya işaret eder. Ayrıca KCl-dirençli suşların farklı pH (3.5, 5.5 ve 7.5) değerlerinde çapraz dirençleri de test edilmiştir. Sonuçlar, düşük pH altında, KCl- dirençli suşların hiçbir direnç veya hassasiyet göstermediğini göstermiştir. Bununla birlikte, yüksek pH altında, KCl-dirençli suşlar hafif bir hassasiyet göstermiştir. Test edilen diğer kimyasalların aksine, katyonik ilaçların ve farklı pH değerlerinin direnç sonuçları; K9, K1 ve K10 suşları arasında korelasyon varlığına işaret etmektedir. K1 ve K9 suşlarının büyüme profilleri çıkartılmış, metabolit (glukoz, asetat, etanol, gliserol) ve depo karbonhidratları (trehaloz ve glikojen) analizleri yapılmıştır. K9 suşu, çapraz direnç sonuçları K1 ve K10 suşlarından farklılık gösterdiği için seçilmiştir. K1 suşu ise hayatta kalma yüzdesi oranı, 1.75 M ve 2 M KCl streslerinde K10 suşundan daha iyi olduğu için seçilmiştir. Sonuçlar, KCl stresine direnç kazandırılmış suşların yüksek miktarda gliserol, ve asetat ürettiğini ve trehaloz depoladığını göstermektedir. Öte yandan, K1 ve K9 suşlarının KCl stres yokluğunda da asetat üretimine devam ettiği gözlemlenmiştir. K1 suşu ise, stres varlığında ve yokluğunda K9 ve referans suşundan daha fazla gliserol üretmiştir: Muhtemelen bu durum, yüksek KCl konsantrasyonunun hiperozmotik strese neden olduğuna ve evrimsel mühendislik sonucu HOG yolağında gerçekleşmiş olası mutasyonların gliserol ve asetat üretimine yol açtığına işaret etmektedir. Sonuç olarak bu çalışmada, evrimsel mühendislikle KCl dirençli iki farklı suş (K1 ve K9) başarıyla elde edilmiştir. Bu dirençli iki suş, farklı çapraz direnç düzeyleri ve metabolit profilleri göstermiştir. Bu durum, farklı metabolik yolaklardaki çeşitli mutasyonlardan kaynaklanıyor olabilir. Hiperozmotik stres tepki veya direnci ile dahili katyon homeostazını düzenleyen karmaşık moleküler ağın aydınlatılabilmesi için, ileriki çalışmalarda genomik ve transkriptomik analizlerin de yapılması gerekmektedir.

Özet (Çeviri)

The yeast Saccharomyces cerevisiae is a well-known model organism, which has a variety of applications in biotechnology. S. cerevisiae is considered a Generally Recognized as Safe (GRAS) organism. The resilience of S. cerevisiae against environmental stress factors such as osmotic, oxidative, freezing-thawing, high temperature, and ethanol stress makes S. cerevisiae an advantageous cell factory for biotechnology. KCl is an odorless white metal halide salt. When it dissolves in water, K+ and Cl- ions are generated. Potassium ion is a vital cation for maintaining membrane potential and a variety of cellular functions such as enzyme activation, osmoregulation, pH regulation, and protein translation. In contrast to Na+ and Li+, K+ is not toxic to the cells. A high ratio of K+/Na+ is imperative for normal cellular functions, because the uptake of K+ reduces the driving force for the uptake of toxic cations to balance membrane potential. Regulation of potassium homeostasis is controlled by complex signaling networks including High Osmolarity Glycerol (HOG), Calcineurin, and Rim pathways. The uptake and efflux of the K+ are mediated by membrane transporter proteins. Trk1,2 transporters are responsible for K+ uptake. On the other hand, Tok1, Nha1, and Ena1-5, 6 transporters control the export of redundant K+. Under normal growth conditions, S. cerevisiae's internal K+ concentration is around 200-300 mM. However, an external concentration of more than 400 mM creates hyperosmotic stress. Exposure to hyperosmotic stress results in immediate water loss and cell shrinkage. To cope with the effect of osmotic stress, yeast cells trigger a couple of osmotic stress responses controlled by the HOG pathway. The most effective strategy against hyperosmotic stress is accumulating compatible osmolytes such as glycerol. Activation of the HOG pathway regulates the transcription of more than 500 genes for stress response. Therefore, understanding the cell response against hyperosmotic stress caused by high concentrations of KCl salt is crucial. In this study, an inverse metabolic engineering strategy, evolutionary engineering was used to obtain KCl-induced hyperosmotic stress-resistant S. cerevisiae. The batch selection was conducted under gradually increasing KCl stress. Before selection, a screening experiment was performed. 0.5 M KCl stress was determined as the initial stress level. The stress level was increased by 0.05 M at each passage until the 22nd population. It was then reduced to 0.02 M. The selection was continued up to 2.5 M KCl stress for 72 populations. After obtaining the final population, 12 randomly selected individual colonies were isolated on plates and named K1-K12. Among them, K1, K9, K10, K11, and K12 have shown better performance at 1.75 M KCl stress. Percent survival rate calculations revealed that at 2 M KCl stress, K9 strain showed 1.9-fold higher resistance compared to the reference (905) strain. Subsequently, genetic stability test was performed, K1, K9, and K10 strains were found to be genetically stable and their resistance to KCl was shown to be permanent. Cross-resistance tests of the genetically stable, evolved strains were performed with various stress types (0.7 M NaCl, 5 mM LiCl, 0.8 M CaCl2, 0.5 mM NiCl2, 7.5 mM AlCl3, 0.75 mM H2O2, 10 % ethanol, 15 mM caffeine, 1.5 M sorbitol, 1 M NH4Cl, 15 mM MnCl2). The K1 and K10 strains showed similar behavior against many stress types: both of them gained resistance against NaCl, H2O2, and slightly LiCl stress. However, the K9 strain showed sensitivity against NaCl, H2O2, LiCl, AlCl3, and caffeine stress. Apart from these chemicals, resistance against cationic drugs (0.5, 0.8, and 1 M TMA, 1.2, 2.5 mM Spermine, 125 μg/mL Hygromycin B) were tested. Tolerance to these toxic cations indicates a reduction in membrane potential. Furthermore, at different pH (3.5, 5.5, and 7.5) values cross-resistance of the evolved strains was tested. The results showed that at low pH evolved strains showed no resistance or sensitivity. However, at high pH evolved strains showed slight sensitivity. Unlike to the other chemicals tested, the resistance results of cationic drugs and different pH seem to be correlated between K9, K1, and K10 strains. Growth profiles, metabolite (glucose, acetate, ethanol, glycerol), and storage carbohydrates (trehalose and glycogen) analyses of K1 and K9 strains were also performed. Strain K9 was chosen because its cross-resistance results differed from the other evolved strains. Strain K1 was chosen because its percent survival rate was higher than that of strain K10 at 1.75 M and 2 M KCl stress levels. The results showed that under KCl stress, the evolved strains produced a high amount of glycerol, and acetate, and they stored trehalose. In the absence of stress, however, acetate was continued to be produced by evolved K1, and K9 strains. K1 strain produced more glycerol than K9 and the reference strain, both in the presence and absence of stress: This may indicate that high KCl concentration causes hyperosmotic stress and possible favorable mutations during evolutionary engineering might have caused the activation of the HOG pathway, which leading to the production of glycerol and acetate. In conclusion, KCl resistant, two distinct strains (K1 and K9) were successfully obtained in this study by evolutionary engineering. The two evolved strains showed different cross-resistance behaviour and metabolite profiles. This might be due to diverse mutations in different metabolic pathways. Further genomics and transcriptomics analyses would be necessary to reveal the complex molecular network that regulates hyperosmotic stress response/resistance and internal cation homeostasis.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    807476

    Evolutionary engineering of freeze-thaw stress-resistant yeasts without using chemical mutagenesis

    Donma-erime stresine dirençli mayaların kimyasal mutajen kullanılmadan evrimsel mühendislik ile elde edilmesi

    İREM BALABAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

  2. Tez No

    439601

    Inverse metabolic engineering of propolis-resistant Saccharomyces cerevisiae

    Tersine metabolik mühendislik yaklaşımıyla propolise dirençli Saccharomyces cerevisiae eldesi

    FİLİZ DEMİR

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2016

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

  3. Tez No

    418982

    Inverse metabolic engineering of aluminium-resistant Saccharomyces cerevisiae

    Tersine metabolik mühendislik yöntemi ile aluminyuma dirençli Saccharomyces cerevisiae eldesi

    NACİYE DURMUŞ İŞLEYEN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2015

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

  4. Tez No

    293925

    Evolutionary engineering of iron-resistant Saccharomyces cerevisiae for biomimetics

    Evrimsel mühendislik yöntemi ile demire dirençli Saccharomyces cerevisiae?nın biyomimetik amaçlı eldesi

    BERRAK GÜLÇİN BALABAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2010

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

  5. Tez No

    172070

    Evolutionary engineering of metal-binding/metal-resistant yeast for biomimetics

    Evrimsel mühendislik yöntemi ile metale bağlanan/metale dirençli mayaların biyobenzetim amaçlı geliştirilmesi

    BURCU TURANLI

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2006

    Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    DOÇ.DR. CANDAN TAMERLER BEHAR

    Y.DOÇ.DR. PETEK ÇAKAR ÖZTEMEL

Geri Dön