The Application of flourescence and absorbtion spectroscopy to the study of penacillin acylase in a solution
Çözelti içerisindeki penisilinin asilazin floresans ve absorbsiyon spektroskopisi ile incelenmesi
- Tez No: 75242
- Danışmanlar: PROF. DR. ÖNDER PEKCAN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Fizik ve Fizik Mühendisliği, Physics and Physics Engineering
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 1998
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Fizik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Fizik Mühendisliği Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 79
Özet
ÖZET ÇÖZELTİ İÇERİSİNDEKİ PENİSİLİN ASİLAZIN FLORESANS VE ABSORBSİYON SPEKTROSKOPİSİ İLE İNCELENMESİ Fotonların bir molekül tarafından soğurulması olarak tanımlanan ışık absorbsiyonu sonucu, molekül temel durumdan uyarılmış duruma geçer. Uyarılmış durumda yaklaşık 10“9 saniye kalan molekül; enerjisini radyasyonlu (ışık ile), ya da radyasyonsuz olarak ortama aktararak tekrar kararlı durum olan temel duruma döner. Radyasyon ile uyarma sonucu molekülün enrjisini ortama radyasyon olarak yayması olayı fotolümenisans ya da lümenisans olarak adlandırılır. Lümenisans; uyarılmış enerji seviyesinin durumuna göre iki şekilde olabilir : Floresans ve fosforesans. Temel seviyedeki bir organik molekül, S0 olarak adlandırdığımız singlet temel elektronik durumda bulunur. Singlet uyarılmış durumda, yüksek-enerji orbitalindeki bir elektron ile düşük-enerji orbitalindeki ikinci bir elektron zıt spin yönelimlerine sahiptirler. Singlet durumu belirleyen zıt spin yönelimli bu elektronlara ”çiftlenmiştir“ denir. Triplet durumda bu elektronlar ”çiftlenmemişlerdir yani aynı spin yönelimine sahiptirler. Singlet uyarılmış durumdan singlet temel duruma dönüş, zıt yönelimli elektronların yönelimlerini değiştirmelerini gerektirmezken, triplet' durumda bu zaruridir. Triplet seviyeden yapılan ışımalar fosforesans olarak adlandırılır. Pauli Dışarlama İlkesi'nden hatırlanacağı gibi aynı spin yönelimine sahip iki elektron bir arada bulunamaz. Floresans ve karakteristik özelliklerine geçmeden önce Alexander Jablonski tarafından önerilen ; floresans ve fosforesans mekanizmasının daha kolay anlaşılmasını sağlayan enerji seviyeleri diyagramım inceleyelim. XII., 1. ve 2. uy, So, Sı ve S2 ile,...., uyanldığı herhangi bir elektronik enerji seviyesinin 0., 1., 2.,... vs titreşim enerji seviyelerinden birinde bulunur. Not edilmesi gereken bir diğer nokta da çeşitli elektronik enerji seviyeleri arasındaki geçişler diktir ve 10“15 saniye gibi kısa bir sürede gerçekleşir. Bu Franck-Condon yasası olarak adlandırılır. Bazı istisnalar dışında, katı fazdaki moleküller uyarıldıktan sonra enerjilerinin bir kısmını titreşim veya ısı olarak ortama aktarırlar ve bu şekilde Sı e inerler. Bu işlem internal conversion olarak bilinir ve 10”saniye gibi kısa bir süre içinde gerçekleşir. Proteinlerin lifetime' lan yaklaşık 10“8 olduğundan internal conversion emisyondan daha kısa bir süre içerisinde gerçekleşir. Sı seviyesinde bulunan moleküller Ti 'e geçerek oradan ışık yayabilirler. Bu işlem de intersystem crossing olarak adlandırılır. Floresans emisyonun üç önemli karakteristik özelliği Stake's kayması, emisyon spektrumunun eksitasyon spektrumundan bağımsızlığı ve ayna görüntü kuralıdır. Stake's kayması floroforun uyarma enerjisinden daha düşük bir enerji ile emisyon vermesi olarak tanımlanabilir. Bu; emisyon spektrumunun absorbans spektrumuna oranla daha büyük dalgaboyuna (düşük enerji) kayması olarak spektrum üzerinde açıkça görülür. îkinci bir karakteristik özellik de floroforun enerjisinin bir kısmım hızlı bir şekilde ortama aktararak Sı inmesi sonucu emisyon spektrumunun uyarma dalgaboyundan bağımsız olmasıdır. Üçüncü bir özellik ise floresans spektrumunun absorbansın ayna görüntüsüdür. Floresans; ışık ile uyarılan organik bir molekülün, birinci uyarılmış singlet elektronik durumdan ışıma yapması olayıdır. Bu durumda elektronlar çiftlendiklerinden floresans kuantum mekaniğince izinli geçişleri içerir. Floresans emisyon bilgileri floroforun kimyasal yapısı ve içinde bulunduğu çözücü ortama bağlı olarak değişiklik gösteren emisyon spektrum aracılığı ile elde edilir. Floresans emisyon spektrumu floresans ışık şiddetinin dalgaboyu ya da dalgasayısına göre değişimidir. Bu çalışmada bir protein olan penisilin asilaz kullanılmıştır. Proteinler amino asitlerden oluşmuştur. Tabiatta 20 çeşit amino asit bulunmaktadır. Proteinlerin oluşmasmda birincil yapılan olarak adlandırdığımız amino asitlerin dizilişleri büyük önem taşımaktadır. Tabiatta bulunan bu 20 amino asitten 3 tanesi aromatiktir ve floresans özellik göstermektedirler. Bu amino asitler Tryptophan (Trp), Tyrosine (Tyr) ve Phenylalanin (Phe)dir. Bu amino asitlerin ışığı maksimum soğurduğu dalgaboylan sırasıyla yaklaşık 280nm, 270nm ve 260nm'dir. Floresans maksimumlan ise sırasıyla yaklaşık 350nm, 303nm ve 282nm'dir. Şunu belirtmek gerekir ki phenylalaninin floresansı çok zayıftır. En güçlü floresans veren amino asit tryptophandır. Proteinlerde floresans konusunda en çok bilgi veren amino asit tryptophan olduğundan genelde proteinler 280nm de uyanlırlar. Penisilin asilaz proteini 31 Tyrosine ve 28 Tryptophan amino asitlerinden oluşmaktadır. xiiiÖlçümler Photon Technology Interaational'dan alınan Quantamaster steady-state floresans spektrometre ile Ultraviolet-Visible spektrofotometre kullanılarak alınmıştır. Bu araştırmada öncelikle penisilin asilazm emisyon spektrumunun konumu ve şekli incelendi. Emisyon spektrumunun beklendiği gibi tryptophamn emisyon spektrumuna benzediği ve 333nm'de maksimum emisyon verdiği gözlendi. İkinci adımda Penisilin asilazm kuantum verimi floresans ve absorbsiyon spektrofotometreleri kullanılarak 0.11 olarak hesaplandı. Ölçümlerde standart olarak tryptophan kullanıldı. Literatürde suda çözünmüş tryptophamn kuantum verimi 0.14 olarak geçmektedir. Penisilin asilaz için bulunan değer tryptophamnkine yakınlığı açısından iyi bir değerdir. Üçüncü adım olarak penisilin asilazın floresans emisyon davranışı sıcaklığın fonksiyonu olarak iki değişik pH için (pH=6 ve 8) incelendi. Bu iki pH değeri için de floresans ışık şiddetinde bir düşme gözlendi. Floresans sönme olarak nitelendirilen bu durum proteinler için pek sık rastlanmayan bir durumdur. 28 tane tryptophan rezidüsü içeren bir protein molekülünde nativ form (globüler yapı) olarak adlandırılan doğal koşullarında, tryptophan protein içinde gömülü bir dağılım göstermektedir. Dolayısıyla ışık ile uyarılan protein molekülü içindeki her tryptophan bu ışığı algılamayacaktır. Isıtılan protein globüler halden rijid hale doğru bir geçiş yapar. Buna proteinin denatürasyonu denir. Bu sırada, molekül içine gömülü tryptophanlar ortama salınırlar. Böylece sıcaklığın artması ile floresans ışık şiddetinde bir artma beklenir. Çalışmalarımız bunun tam tersini göstermiştir. Bu sönmenin uyarılmış durumdaki tryptophan rezidüleri arasındaki enerji transferlerinden kaynaklanabileceği düşüncesiyle, enerji transferlerini incelemek üzere yeni bir deney planlanmıştır. Burada belirtilmesi gereken bir nokta da; ıstıldıktan sonra soğutulan protein molekülünün kısmi olarak eski formuna döndüğü, floresans ışık şiddetindeki restorasyon ile takip edildi. Ayrıca pH 6 mn pH 8 den daha çok onanldığı gözlendi. Uyarılmış durumdaki enerji transferlerini incelemek için ANS (8-anilinonaphtalene- 1 -sulfonic acid ) adlı floresant malzeme kullanıldı. ANS ışığı 374nm de maksimum absorblamakta ve 474nm de maksimum floresans emisyon vermektedir. Belirli konsantrasyonlarda hazırlanan PA ANS karışımının floresans emisyonu sıcaklığın fonksiyonu olarak incelendi. Artan ısıyla PA-ANS karışımının kompleks oluşturduğu gözlendi. Bunu; ANS 'in kendine özgü emisyon spektrumumunun şeldinin ve pozisyonunun değişmesi olarak floresans spektrometre ile gözlemledik. Bu çalışmada floresans spektrometresiyle enerji transferlerini proteini uyardığımızda ANS 'in emisyon vermesi şeklinde, yani tryptophanların enerjilerini ANS'lere aktarması olarak takip edildi. Bir sonraki adımda proteinin uyarılmış durumdaki dinamiğini incelemek için eksitasyon ve emisyon polarizasyon spektrumlan elde edildi. Polarizasyon ölçümlerinde önemli bir nokta ölçülen polarizasyon değeri ile ölçülmek istenenin aynı olmamasıdır. Bunun sebebi emisyon monokromatörünün ışığı dik ve yatay yönelimli polarizörler için aynı verimle geçirmemesidir. Polarizasyon formülü: xivI//-U p= I//+Il iken bir düzeltme yapılarak, emisyon monokromatörünün ideal olmayan bu etkisi ortadan kaldırılır. Yeni polarizasyon formülü: Iw-GIvh Ivv+GIvh şeklindedir. Buradaki G-Faktörü düzeltme faktörüdür ve Ihv G = Ihh olarak tanımlanır. Yapılan eksitasyon polarizasyon ölçümleri sonucu 285nm'de proteinin tryptophana nazaran daha çok depolarize olduğu görüldü. Bunun sebebi proteinin dönmesi olamazdı. Çünkü dönmeyi ifade eden ”rotational correlation time" yaklaşık 25ns olarak bulundu. Bu proteinlerin uyarılmış seviyede kalma süresinden ( yaklaşık 3- 5ns ) çok yüksek olduğu için uyarılmış durumda proteinin dönmesi imkansızdı. Bundan yola çıkılarak bu depolarizasyonun sebebinin protein molekülü içindeki tryptophanlar arasındaki enerji transferlerinden kaynaklanabileceği sonucuna varıldı. Ayrıca eksitasyon polarizasyon spektrumunda herhangi bir yapı gözlenmedi. Örnek iki ayrı dalga boyunda :287 ve 305nm de uyarılarak emisyon polarizasyon spektrumu elde edildi ve 287nm de uyarılarak aide edilen spektrumun dalga boyundan bağımsız olduğu saptandı. 305nm için ise dalgaboyuna kuvvetli bir bağlılık gözlendi. Bunun protein floresansının heterojenliği ile ilişkili olduğu sonucuna varıldı. Her iki eksitasyon ve emisyon polarizasyon spektrumlan hyaluronidase adlı bir enzim için yapılan polarizasyon ölçümlerine paralel sonuç vermiştir. Araştırmanın son aşamasında penisilin asilazm absorbans spektrumunun birinci, ikinci, üçüncü ve dördüncü türevleri spektrofotometrenin Math komutunda uygun parametreler seçilerek alındı. Sonuçlar tryptophanın türevleri ile karşılaştırıldı. XVPenisilin asilazın birinci türev grafiğinde tyrosine ve phenylalanin varlığı açık bir şekilde gözlendi. Üçüncü türevde 290nm sonrasında tryptophanlann ortamla etkileşimleri spektrum üzerinde açıkça izlenebildi. Bu çalışmadan şöyle bir sonuca varıldı. Bilindiği gibi türev, spektradan daha fazla bilgi vermez ancak türev sayesinde çok küçük yapılar daha keskin tepeler haline gelirler yorum yapmayı kolaylaştırırlar. Bu değişik parametrelerin (örneğin sıcaklık ) fonksiyonu olarak proteindeki konformasyonel değişikliği takip edebilme olanağını sağlar. XVI
Özet (Çeviri)
SUMMARY Fluorescence emission of penicillin acylase was characterized by position of emission spectrum and over quantum yield, excitation and emission wavelength dependent of polarization. The results demonstrate the relatively nonpolar environment of tryptophan residues and their high quantum yields. Temperature dependence of fluorescence spectra allowed to discover unusual phenomenon; a very strong quenching of tryptophan fluorescence on the increase of temperature from 20 to 52 °C. This effect of quenching was only partially reversible. (More reversible at pH=6 than pH=8 ). We observed that penicillin acylase binds fluorescent indicator- ANS and the excited energy can be transferred from tryptophan to bound ANS. This transfer increases with the increase of the temperature. The studies on polarization spectra in excitation and emission allowed to observe some depolarization, which may be the result of excitation energy transfer between tryptophans and/or intramolecular motions of these tryptophans. The electronic absorption derivative spectra of penicillin acylase were obtained, which display some differences when compared with tryptophan in solution. Especially wavelength longer than 290 nm we observed some structure at fourth derivative of penicillin acylase relative to tryptophan, which can be interpreted as tryptophan interactions inside protein molecule. Therefore the study of derivative spectra may be promising in analysis of protein denaturation under different factors. XI
Benzer Tezler
- Metiyonin biyomolekülü ile modifiye edilmiş kromenilyum -siyanin floresan probun sentezi, çevrede ve canlı hücrelerde cıva(II) analizi uygulamaları
Synthesis of a methionine biomolecule-modified chromenylium-cyanine fluorescent probe and its application of mercury(II) analysis in the environment and living cells
YUSUF ALÇAY
- Demir(III) iyonuna hassas, tiyofen ile modifiye edilmiş rodamin tabanlı yeni tip sensörün sentezi, karakterizasyonu ve uygulamaları
Synthesis, characterization and applications of the iron(III) ion sensitive, thiophene modified rodamine-based new type of sensor
HÜLYA ARIBUĞA
- Cıva (II) iyonuna seçici, merkaptopropiyonik asit ile türevlendirilmiş kromenilyum-siyanin tabanlı yeni bir turn-on floresan sensörün geliştirilmesi
Development of a new – mercury (II) ion selective, chromenyllium-cyanine based turn-on fluorescent sensor derivatived wi̇th mercapto propionic acid
VUSLAT BASAN
- Kumarin türevlerinin sentezleri, karakterizasyonlari ve sensör uygulamalari
Synthesis, characterization and sensor applications of the coumarin derivatives
DERYA TOPKAYA TAŞKIRAN
- Hidrazinlenmiş bazı kalkon türevlerinin insan serum albumin ve model membran sistemlerdeki floresans karakteristiği
Fluorescence characteristic of hydrasinated some chalcone derivatives in human serum albumin and model membrane systems
BERAT YILDIRIM
Yüksek Lisans
Türkçe
2020
KimyaErzincan Binali Yıldırım ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ BURCU MERYEM BEŞER