Towards In Vitro synthesis of oxygen-tolerant CpI hydrogenase variants for photosynthetic hydrogen production
Fotosentetik hidrojen üretimi için oksijene toleranslı CpI hidrojenazvaryantlarının In Vitro üretim çalışmaları
- Tez No: 761360
- Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ CEM ALBAYRAK, PROF. DR. İBRAHİM HALİL KAVAKLI
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Enerji, Biyomühendislik, Biotechnology, Energy, Bioengineering
- Anahtar Kelimeler: Hidrojen, Protein sentezi, Taşıyıcılar, İn vitro, Hydrogen, Protein synthesis, Conveyors, In vitro
- Yıl: 2022
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Koç Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Hidrojen, karbon içermeyen yapısı ve yüksek enerji yoğunluğu nedeniyle fosil yakıtlar gibi yenilenemeyen enerji kaynaklarına çekici bir alternatiftir. Bununla birlikte, hidrojen üretiminin çoğu, fosil yakıtlardan türetilen hammadde kimyasallarını kullanır, bu da karbondioksit emisyonuna yol açar ve iklim krizine katkıda bulunur. Fotosentetik hidrojen teknolojisi, alternatif, sürdürülebilir ve tamamen karbonsuz bir enerji döngüsü sağlayabilir. Bununla birlikte, oksijen fotosentezin bir yan ürünü olduğundan, hidrojen üretimini katalize eden hidrojenaz enzimlerinin oksijen duyarlılığı, fotosentetik hidrojen üretiminin önündeki en önemli engellerden biridir. Bu nedenle fotosentetik hidrojen üretiminde kullanılacak hidrojenaz enziminin gaz halindeki oksijeni tolere etmesi gerekir. Bu tezde, Clostridium pasteurianum (CpI) hidrojenazında oksijen toleransı için önemli olduğu bilinen dört yer, kanonik olmayan amino asit (ncAA) eklenebilmesi için amber (TAG) durdurma kodonu ile değiştirildi. Hidrojen üretimi açısından karakterize edilen en verimli ve hızlı [Fe-Fe] hidrojenazlardan biri olduğu için CpI seçilmiştir. Enzim üzerinde seçilen noktalara hücresiz protein sentezi (CFPS) kullanılarak ncAA eklenmesi yönünde önemli ilerleme kaydedilmiştir. Sistein ve tirozin analogunun dahil edilmesi için gerekli olan M. Jannaschii türevi altı aminoasil-tRNA sentetazının (aaRS'ler) genleri ilk olarak yüksek kopyalı pY71 vektörüne klonlandı. Bu aaRS'ler daha sonra in vivo olarak üretildi ve genetik olarak kaynaşmış N-terminal 6xHis-etiketlerine sahip oldukları için IMAC ile saflaştırıldı. ncAA yerleştirilmesi için gerekli olan ortogonal tRNACUA şablonu da PCR ile sentezlendi ve saflaştırıldı. Tezin bir sonraki bölümünde, histidin analoglarının katılması için gerekli olan M. barkeri türevi aminoasil tRNA sentetaz, HRS'nin sentezlenmesi için deneyler yapıldı. Enzimin in vivo ve in vitro (CFPS) sentezi için farklı koşullar test edildi. Ancak HRS, çözünmeyen agregatlar oluşturdu ve saflaştırılamadı. Son olarak, M. barkeri'den türetilen ortogonal tRNA şablonu, PCR montajı ile üretildi ve saflaştırıldı. Son bölümde, doğal-tip CpI, anaerobik olarak in vivo olarak üretildi ve olgunlaştırıldı, ardından StrepTactin afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırıldı. CpI'ın hidrojen üretim aktivitesini ölçmekte kullanılan iki biyokimyasal tahlil (NADPH ve DTH güdümlü) için gerekli olan bileşenler sentezlendi. Aktivite deneyleri ile anaerobik olarak üretilen ve saflaştırılan CpI enziminin aktif durumda olduğu gösterildi. CFPS'de de anaerobik olarak CpI üretme girişimleri yapıldı, ancak bu başarısız oldu. Ancak hem doğal-tip hem de mutant CpI'nin CFPS üretimi için gerekli olan her şey hazırlandı.
Özet (Çeviri)
Hydrogen is an attractive alternative to non-renewable energy sources like fossil fuels due to its carbon-free nature and high energy density. However, most of hydrogen production uses feedstock chemicals derived from fossil fuels, which leads to carbon dioxide emissions and thus contributes to the climate crisis. Photosynthetic hydrogen technology can provide an alternative, sustainable and entirely carbon-free energy cycle. However, oxygen sensitivity of the hydrogenase enzymes that catalyze hydrogen production is one of the most significant barriers against photosynthetic hydrogen production, as oxygen is a by-product of photosynthesis. Therefore, the hydrogenase enzyme to be used in the production of photosynthetic hydrogen must tolerate gaseous oxygen. In this thesis, four locations known to be important for oxygen tolerance in the Clostridium pasteurianum (CpI) hydrogenase were replaced with the amber (TAG) stop codon for non-canonical amino acid (ncAA) incorporation. CpI was chosen as it is one of the most efficient and fast [Fe-Fe] hydrogenases characterized in terms of hydrogen production. Significant progress was made toward ncAA insertion using cell free protein synthesis (CFPS) to the selected spots on the enzyme. The genes of six M. jannaschii-derived aminoacyl-tRNA synthetases (aaRSs) required for cysteine and tyrosine analog incorporation were first cloned into the high- copy pY71 vector. These aaRSs were then produced in vivo and purified with IMAC as they have genetically fused N-terminal 6xHis-tags. The orthogonal tRNACUA template necessary for ncAA insertion was also synthesized with PCR and purified. In the next part of the thesis, experiments were performed to synthesize M. barkeri- derived aminoacyl tRNA synthetase, HRS, necessary for histidine analog incorporation. Different conditions were tested in vivo and in vitro (CFPS) synthesis of the enzyme. However, HRS formed insoluble aggregates and could not be purified. Lastly, the M. barkeri-derived orthogonal tRNA template was produced by PCR assembly and purified. In the last part, wild-type CpI was anaerobically produced and matured in vivo, followed by purification using StrepTactin affinity chromatography. The components required for the two biochemical assays to measure the hydrogen production activity of CpI, namely NADPH- and DTH-driven assays, were synthesized. With the activity assays, the anaerobically produced and purified CpI enzyme was shown to be in the active state. Attempts were made to produce CpI anaerobically in CFPS as well, however this was unsuccessful. But everything necessary for CFPS production of both wild-type and mutant CpI was prepared.
Benzer Tezler
- Design, synthesis and investigation of in vitro therapeutic effects of silicon-substituted xanthene based phototheranostic agents
Silisyum-ksanten tabanlı fototeranostik ajanlarının tasarımı, sentezi ve terapötik etkilerinin incelenmesi
SULTAN ÇETİN
- Barsak enflamasyonu oluşturulan hücre kültür modelinde, timokinonun biyolojik aktiviteleri ile metabolomik profillemesinin araştırılması
Investigation of the biological activities and metabolomic profiling of thymoquinone in an in vitro model of intestinal inflammation
ÖZNUR YAŞAR
- Multifonksiyonel heterohalkalı bileşiklerin sentezi
Synthesis of multifunctional heterocyclic compounds
FATMA ALBAYRAK HALAÇ
- Yeni ftalosiyanin türevlerinin sentezi karakterizasyonu ve fotosensör uygulamaları
Synthesis, characterization and photosensor applications of newphthalocyanine derivatives
FATMA ASLIHAN SARI
- Difüz optik görüntüleme esaslı, doku oksijen doyumu ölçümü
Diffuse optical imaging based, tissue saturation measurement
ŞEYDA ÖZKAYA
