Re-establishment of fertilization competency of the oocyte via CRISPR/DCAS9 epigenome edıtıon technology
CRISPR/DCAS9 epigenom düzenleme teknolojisi kullanılarak oositin döllenme yeteneğinin geri kazandırılması
- Tez No: 766323
- Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ SERÇİN KARAHÜSEYİNOĞLU, PROF. ÖZGÜR ÖKTEM
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Genetik, Histoloji ve Embriyoloji, Genetics, Histology and Embryology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2022
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Koç Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Üreme Tıbbı Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 122
Özet
Kadın ve erkek infertilitesi günümüz dünyasının en başta gelen önemli problemlerinden biridir. Infertilite sebepleri arasında sayılan çevresel ve genetik faktörler birçok araştırmaya konu olmaktadır. Melamin, endüstride çok sıklıkla yapıştırıcıların hammaddesi olarak, lamine yüzeyleri ve gereçleri kaplamak amacıyla kullanılan ve infertiliteye sebep olabilecek çevresel faktörler arasında sayılan bir malzemedir. Melamin, süt ürünlerine eklendiğinde nitrojen içeriği sebebiyle yanlış protein artışlarına sebep olabilmektedir. Bunun yanısıra, kimyasal melamine uzun süre maruz kalınması, yenidoğanlarda karaciğer, böbrek ve fertilite problemlerine neden olmaktadır. Oosit kalitesini düşürmesi sebebiyle kadınlarda infertiliteye sebebiyet verdiği gösterilmiştir. Son zamanlarda melaminin, sperm IZUMO1 reseptörü olarak tanımlanan JUNO ekspresyonunu baskıladığı da yapılan araştırmalarca ispatlanmıştır. JUNO'nun döllenme için gerekli ve JUNO hasarı olan farelerin infertil olmasına bağlı olarak, melaminin fertilite üzerindeki etkisinin JUNO baskılanması ile ilişkili olduğu öne sürülmüştür.Bu projede bu ilişkiyi araştırmak ve potansiyel klinik bir yaklaşım geliştirmek amacıyla, oositlerde çevresel faktör kaynaklı infertilite modeli oluşturmak ve CRISPR/dCas9 aktivasyon sistemlerini kullanarak döllenme kapasitesini eski haline getirmek amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda, ilk olarak CRISPR/dCas9 SAM ve Tet1 sistemleri kullanılarak HEK293T hücrelerinde JUNO genini aktive edilmiştir. SAM sistemi kullanılarak JUNO gen ekspresyonunda 200 kat artış sağlandığı qPCR ile gösterilmiştir. Fare spermlerinin, JUNO proteininin sperm bağlama kapasitesini ve yaklaşımımızın potansiyelini doğrular şekilde, JUNO ile aktive olan HEK293T hücrelerine bağlandığı gösterilmiştir. Stratejimizin klinik potansiyelini test etmek amacıyla, bastırılmış JUNO ekspresyonuna sahip fare modeliyle melamin, sham ve kontrol gavaj olmak üzere 3 farklı deney grubu oluşturulmuştur. Farelere her iki günde bir sonda ile 50 mg/kg melamin verilmiştir. Üç haftalık tedaviden sonra, melamine maruz kalan oositlerde JUNO ekspresyonunda önemli bir azalma olduğu gösterilmiştir. Bunun yanısıra, melaminin toplam oosit sayısını azalttığı, atretik foliküllerin sayısını arttırdığı ve JUNO ekspresyonunu granulosa hücrelerinde azalttığı gösterilmiştir. Yaklaşımımızın tedavisel potansiyelini göstermek amacıyla, JUNO ekspresyonu azaltılmış olan oositlere dCas9 bazlı aktivatör proteinler ve kopyalanan gRNA mikroenjeksiyon metoduyla verilmiştir. qPCR ve IF yöntemleri kullanılarak, JUNO ekspresyonunun oositlerde tekrar arttığı gösterilmiştir. Fertilizasyon testi kullanılarak melamin uygulanmış oositlerde 2 hücreli embriyo oranı %46 olarak bulunurken, melamin uygulanmış ve dCas9 bazlı aktivatör enjekte edilmiş oositlerde bu oran %76'ya çıkmıştır. Sonuçların tümüne bakıldığında başarılı bir infertilite modeli oluşturulduğu ve CRISPR/dCas9 aktivasyon sistemlerini kullanarak oositlerin döllenme kapasitesini geri kazandırılabildiği gösterilmiştir. Bu çalışma, farklı infertilite problemlerinin üstesinden gelmek için uygulanabilecek özgün bir yaklaşım önermektedir.
Özet (Çeviri)
Male and female infertility is one of the most important problems in modern world. Many studies have been conducted on environmental factors and genetic factors, which are among the causes of infertility. Melamine which is used very frequently in the industry as the raw material of many adhesives, laminated surface coatings and dishes, was shown to be one of these environmental factors. When melamine is added to dairy products, it causes a false protein increase because of its nitrogen content. Long-term exposure of the body to the chemical melamine can cause many kidney and liver problems and infertility in newborns. It was suggested to cause infertility in women by decreasing the quality of oocyte. Recently, melamine was shown to suppress the JUNO expression which was identified as the sperm IZUMO1 receptor. As JUNO is essential for fertilization, and mice with JUNO damage are infertile, effect of melamine on fertility was suggested to be related with JUNO suppression. To investigate this relationship and suggest a potential clinical approach, we aimed to establish an environmental factor-induced infertility model in oocytes and restore fertilization capacity using CRISPR/dCas9 activation systems. To this end, we first activated the JUNO gene in HEK293T cells using the CRISPR/dCas9 SAM and Tet1 systems. As shown by qPCR, a 200-fold increase was achieved in JUNO gene expression using the SAM system. Mouse sperms were shown to bind to JUNO-activated HEK293T cells, which confirmed the sperm binding capacity of the JUNO protein, and potential of our approach. To test the clinical potential of our strategy, we generated a mice model with suppressed JUNO expression consisting of three groups: control, sham, and melamine gavage. Mice were given 50 mg/kg of melamine by gavage every two days. After three weeks of treatment, significant decrease in JUNO expression was shown in melamine-exposed oocytes. Melamine was also decreased the total number of oocytes, an increase in the number of atretic follicles, and a decrease in the expression of JUNO in granulosa cells. To demonstrate the therapeutic potential of our approach, dCas9-based activator proteins and transcribed gRNA were given by microinjection into the oocytes with decreased JUNO expression. Using qPCR and IF methods, JUNO expression was demonstrated to increase back in oocytes. Using a fertilization assay, the 2-cell ratio was found to be 46% in melamine treated oocytes, while this ratio increased to 76% in melamine treated and dCas9-based activator injected oocytes. Together, our results indicated that we have generated a successful infertility model, and by utilizing CRISPR/dCas9 activation systems, we restored the fertilization capacity of oocytes. This study suggests an original approach which can be applied to overcome different infertility problems.
Benzer Tezler
- Re-establishment of the political system in the transition to multi-party life (1945-1950) in the context of the concept of democracy
Çok partili hayata geçiş sürecinde (1945-1950) siyasal sistemin demokrasi kavramı bağlamında yeniden tesisi
İBRAHİM ÇEVİK
Yüksek Lisans
İngilizce
2023
Siyasal BilimlerAnkara Yıldırım Beyazıt ÜniversitesiSiyaset Bilimi ve Kamu Yönetimi Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AYTAÇ YILDIZ
- Karşılıklı diplomasiye geçiş sürecinde Osmanlı daimi elçiliklerinin Avrupa'da yeniden tesisi 1832-1841
Re-establishment of the constant Ottoman embassies on mutual diplomacy transition period in Europe 1832-1841
AHMET DÖNMEZ
- Türkiye'nin lojistik karaköprüsü olarak yapılandırılmasında denizyolu ulaştırmasının rolü: Senaryo yaklaşımı
The Role of maritime transportation in re-establishment of Turkey as a logistics landbridge: A scnerio approach
HAKAN ÇETİNOĞLU
Doktora
Türkçe
2007
DenizcilikDokuz Eylül ÜniversitesiDenizcilik İşletmeleri Yönetimi Ana Bilim Dalı
DOÇ.DR. OKAN TUNA
- Israel's rapprochement with Russia in the post-cold war era (1991-2011): A diaspora effect?
Soğuk savaş sonrası Israil'in Rusya ile yakınlaşması (1991-2011): Diaspora etkisi mi?
FATİH ŞEMSETTİN IŞIK