Geri Dön

Evagreen ve taqman tabanlı gerçek zamanlı RT-PCR analizlerinin validasyonu ve karşılaştırılması: apis mellifera'da black queen cell virusunun kantitatif moleküler teşhisi için yeni yaklaşımlar

Validation and comparison of evagreen- and taqman-based REAL-time RT-PCR assays: novel approaches for quantitative molecular diagnosis of black queen cell virus in apis mellifera

PDF İndir

  1. Tez No: 789025
  2. Yazar: MUSTAFA EMİN ÖZ
  3. Danışmanlar: DOÇ. DR. OĞUZHAN AVCI
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Genetik, Mikrobiyoloji, Veteriner Hekimliği, Genetics, Microbiology, Veterinary Medicine
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2023
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Selçuk Üniversitesi
  10. Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Viroloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Viroloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 182

Özet

Black queen cell virus (BQCV), bal arılarında genelde subklinik enfeksiyon oluşturan ve küresel dağılım gösteren yaygın bir virustur. BQCV'nin diğer bazı bal arısı patojenleriyle (acute bee paralysis virus, deformed wing virus, Nosema spp.) karşılıklı potansiyel sinerjik etkileşiminin ve bal arısı biyolojisinde keşfedilmeyi bekleyen etkilerinin anlaşılması araştırmacıların ilgisini çekmiştir. Bu çalışmanın amacı, erişkin arı ve larva-pupada BQCV'nin tespiti için BQCV yapısal protein (SP-VP1) ve yapısal olmayan protein (NSP-RdRp) genlerin amplifikasyonuna dayanan TaqMan prob ve EvaGreen (EG) dye tabanlı kantitatif real-time reverse transcriptase PCR (qRT-PCR) analizlerinin geliştirilmesi ve validasyonunun gerçekleştirilmesidir. Ayrıca real-time RT-PCR analizleri için yaygın kullanılan EG dye ve TaqMan prob kimyasallarının analiz performansları karşılaştırıldı. Analizlerin validasyonu için hazırlanan standart RNA alikotları ile oluşturulan standart eğrilere dayalı metot etkinlik hesapları, lineer regresyon performansı ve güvenilirlik değerlerine dayalı doğruluk profilleri bu analizlerin doğruluk, kesinlik, kabul edilebilirlik ve güvenilirlik açısından uygun olduğunu kanıtladı. BQCV-SP TaqMan ve EG real-time qRT-PCR analizleri için çalışma aralığı sırasıyla 2,61-7,61 log10 RNA kopyaları/reaksiyon ve 2,61-7,79 log10 RNA kopyaları/reaksiyon arasında belirlendi. BQCV-NSP TaqMan ve EG real-time qRT-PCR analizleri için çalışma aralığı sırasıyla 6,83-11,83 log10 RNA kopyaları/reaksiyon ve 6,98-11,98 log10 RNA kopyaları/reaksiyon arasında tespit edildi. Bu yeni analizleri kullanarak Akdeniz ve İç Anadolu Bölgelerinde doğal olarak enfekte olmuş kovanlarda BQCV'nin prevalansı ve viral yükü hesaplandı. BQCV'nin prevalansı erişkin arı ve larva-pupada sırasıyla %84 ve %44 bulundu, viral yükü ise validasyon sürecinde belirlenen analizlerin çalışma aralığındaydı. Saha örneklerinin tamamı asemptomatik olduğundan, bu analizleri kullanarak BQCV'nin gizli ve açık enfeksiyonu arasındaki ayrımı tahmin edebilecek bir viral genom yükü önerilemedi. Ancak larva-pupaların asemptomatik enfeksiyonunda BQCV-SP real-time qRT-PCR analizi için ≤8,80 log10 RNA kopyalar/reaksiyon ve BQCV-NSP real-time qRT-PCR analizi için ≤11,80 log10 RNA kopyalar/reaksiyon gibi bir tanı eşik değeri bulundu. EG dye ve TaqMan prob kimyasallarının analitik ve tanısal performans analizlerinde kıyaslanabilir sonuçlar elde edildi ve hesaplanan Ct değerleri arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmadı (Wilcoxon Signed Ranks Test 2-tailed). Böylece EG'nin, Taqman proba benzer olarak, real-time RT-PCR analizleri için sağladığı yüksek amplifikasyon etkinliği teyit edildi. Sonuç olarak BQCV'nin tespiti için son derece hassas ve analitik olarak spesifik olan bu yeni real-time qRT-PCR analizlerinin, BQCV'nin etiyolojik ve epidemiyolojik çalışmalarına katkı sağlayacağı ifade edilebilir.

Özet (Çeviri)

Black queen cell virus (BQCV) is a common virus that causes covert infection in hives and has a global distribution. It is of interest to honey bee virologists to understand the potential synergistic interaction between BQCV and some other honeybee pathogens (acute bee paralysis virus, deformed wing virus, Nosema spp.) and to elucidate the unexplored effects of BQCV in honey bee biology. This study aims to develop and validate the TaqMan probe and EvaGreen (EG) dye-based real-time reverse transcriptase PCR (qRT-PCR) assays based on the amplification of the BQCV structural protein (SP-VP1) and non-structural protein (NSP-RdRp) genes for BQCV detection in adult honey bees and larva-pupa. Additionally, the analysis performances of commonly used EG and TaqMan chemicals for real-time RT-PCR analyses were compared. Method efficiency calculations based on standard curves created with standard RNA aliquots prepared for the validation of the analyses, linear regression performance, and accuracy profiles based on reliability values proved that these analyses were proper in terms of accuracy, precision, acceptability, and reliability. The operating range for BQCV-SP TaqMan and EG real-time qRT-PCR analyses was calculated from 2,61 to 7,61 log10 RNA copies/reaction and 2,61 to 7,79 log10 RNA copies/reaction, respectively. The operating range for BQCV-NSP TaqMan and EG real-time qRT-PCR analyses was calculated from 6,83 to 11,83 log10 RNA copies/reaction and 6,98 to 11,98 log10 RNA copies/reaction, respectively. Using these novel analyses, the prevalence and viral load of BQCV were calculated in naturally infected hives in the Mediterranean and Central Anatolia Regions. The prevalence of BQCV was found to be 84% and 44% in adult honey bees and larvae-pupae, respectively. BQCV viral load was within the operating range of the analyses determined during the validation. All of these samples had the covert infection. Therefore, a viral genome load that could predict the distinction between covert and overt infection of BQCV using the analyses could not be proposed. However, a diagnostic threshold value of ≤8,80 log10 RNA copies/reaction for BQCV real-time qRT-PCR analysis and ≤11,80 log10 RNA copies/reaction for BQCV real-time qRT-PCR analysis was found in the covert infection of larvae-pupae. Comparable results were obtained in analytical and diagnostic performance analyses of the EG dye and TaqMan probe chemicals, and no statistically (Wilcoxon Signed Ranks Test 2-tailed) significant difference was found between the calculated Ct values. Thus, the high amplification efficiency of the EG dye for RT-PCR analyses was confirmed, similar to the Taqman probe. In conclusion, highly sensitive and analytically specific for the detection of BQCV, these novel real-time qRT-PCR assays will benefit the etiological and epidemiological studies of BQCV.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    424105

    Gıda patojenlerinin tespiti için floresan temelli ekonomik DNA test yöntemlerinin geliştirilmesi

    Development of economical flourescence based DNA test methods for foodborne pathogen detection

    AHMET KAYNAK

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2015

    BiyomühendislikÇanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi

    Biyomühendislik ve Malzeme Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. ERGÜN ŞAKALAR

  2. Tez No

    392419

    Development of evagreen real-time PCR assay for the molecular identification of potato brown rot disease causing agent R. solanacearum

    Patateste kahverengi çürüklük hastalığına sebep olan R. solanacearum'un moleküler tanısının evagreen gerçek-zamanlı PZR yöntemiyle geliştirilmesi

    ZEHRA EKİNCİ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2014

    BiyomühendislikFatih Üniversitesi

    Genetik ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. MUSTAFA FATİH ABASIYANIK

  3. Tez No

    776196

    SARS-COV-2 enfeksiyonu ve sonrasında nazofaringeal ve orofaringeal sürüntü örneklerinde mRNA ekspresyonlarının araştırılması

    Investigation of mRNA expressions in nasopharyngeal and oropharyngeal swab samples in active SARS-COV-2 infection and after SARS-COV-2 infection

    BURCU ÇAYKARA PERAN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    Fizyolojiİstanbul Medeniyet Üniversitesi

    Fizyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. GÜLER ÖZTÜRK

  4. Tez No

    335915

    Development of fast and economic QPCR-based method for meat species detection

    Hızlı ve ekonomik et tür tayini için QPCR tabanlı bir yöntem geliştirilmesi

    EDA ÇİFTÇİ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2013

    Genetikİstanbul Teknik Üniversitesi

    Biyoloji Bölümü

    DOÇ. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY

    DR. MUSTAFA KOLUKIRIK

  5. Tez No

    866417

    Mikrodalga uygulanan MIR604 ve MON810 mısır unlarının omik yaklaşım ile karakterizasyonu

    Characterization of microwave-treated MIR604 and MON810 maize flours with omics approach

    BEGÜM ZEYNEP HANÇERLİOĞULLARI

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    Gıda MühendisliğiHacettepe Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. REMZİYE YILMAZ

Geri Dön