Investigating the oncogenic function of brain specific cyp4x1 gene in glioblastoma cancer cells using RNA-i mediated gene repression strategy
Glioblastom kanser hücrelerinde beyine özgü cyp4x1 geninin onkojenik fonksiyonunun RNA-i aracılı gen susturma stratejisiyle incelenmesi
- Tez No: 807997
- Danışmanlar: PROF. ORHAN ADALI, PROF. ŞEVKİ ARSLAN
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyokimya, Genetik, Onkoloji, Biochemistry, Genetics, Oncology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2023
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyokimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Biyokimya Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 118
Özet
Beyin tümörü hücreleri patalojik damar yapıları geliştirmektedir. Bu durum, vasküler hücreleri beyin tümörü tedavisinde birincil ilaç hedefleri haline getirmiştir. Araşidonik asit ve endojen amid formu araşidonoil etanol amid (anandamid), kanser hücresi anjiyogenezi üzerinde düzenleyici bir etkiye sahiptir. Bu nedenle, bu endojen bileşiklerin metabolizmasından rol oynayan enzimler sıklıkla anjiyojenik hedefler olarak araştırılmaktadır. Sitokrom P450 enzim ailesinin yeni üyesi CYP4X1'in spesifik olarak beyinde eksprese edilmesi ve anandemidi metabolize etmesi, bu genin beyin tümörü anjiyojenezinin düzenlenmesi için yeni bir hedef olarak düşünülmektedir. Bu çalışma, T98-G insan glioblastoma multiforme hücre hattı kullanılarak CYP4X1 geninin beyin tümörü anjiyogenezindeki potansiyel ilişkisini araştırmaktadır. CYP4X1 ekspresyonu, CYP4X1 mRNA'sını hedefleyen Silencer Select siRNA karışımı ve hedefsiz (negatif) kontrol siRNA'sı kullanılarak RNA interferans (RNAi) sistemi aracılığıyla baskılandı. Ayrıca CYP4X1 geninin olası anjiyojenik etkisini anlamak için VEGF-A gen ve protein ifadeleri T98-G hücrelerinde sırasıyla q-RT PCR ve Western blot teknikleri kullanılarak incelenmiştir. Sonuçlarımız, T98-G hücrelerinde CYP4X1 gen ifadesinin baskısından sonra, VEGF-A gen ifadelerinin önemli ölçüde azalmasına rağmen, protein ifadelerinin değişmediğini göstermektedir. Buna ek olarak, hücrelerin içinde büyütüldüğü besiyerleri toplanarak sandviç ELISA yöntemi ile ölçülen VEGF-A sekresyonu, siRNA transfekte edilmiş grupta kontrol grubuna göre önemli ölçüde azalmıştır. CYPX1'in vasküler endotelyal hücrelerdeki etkisini daha fazla araştırmak için insan göbek endotel damarı (HUVEC) hücre hattı kullanıldı. Gruplar arasında HUVEC hücre proliferasyonlarında istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlenmedi. Ayrıca Matrigel üzerinde HUVEC hücreleri kullanılarak in vitro anjiyogenez modeli oluşturuldu ve ışık mikroskobu kullanılarak tüp uzunluğu, ilmek oluşumu ve dallanma noktaları sistemi değerlendirildi. CYP4X1 baskısı altında tüm parametreler azalmış görünüyordu. Son olarak, peroksizom proliferatörle aktive olan reseptör (PPARa) protein ifadelerindeki değişiklikler, CYP4X1 aracılı anjiyogenezin arkasındaki olası bir mekanizma olarak western blot tekniği kullanılarak belirlendi. Kontrol ve CYP4X1 siRNA ile muamele edilen gruplar arasında PPARa protein ekspresyonunda istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlenmedi. Genel olarak, burada elde edilen sonuçlar, CYP4X1 geninin beyin tümörü anjiyogenezi için umut verici bir alternatif hedef olduğunu göstermektedir. Bildiğimiz kadarıyla bu tez çalışması, siRNA aracılı gen baskılama stratejisi ile insan hücre hatlarında beyin tümörü anjiyogenezinde CYP4X1 geninin olası rolünü araştıran ilk çalışmadır.
Özet (Çeviri)
Brain tumor cells show an aberrant blood vessel formation which makes angiogenesis a potential target for brain tumor treatment. Arachidonic acid and its endogenous amide, arachidonoyl ethanol amide (anandamide) are known to have a regulatory impact on cancer cell angiogenesis. Therefore, enzymes which are responsible for the metabolism of these endogenous compounds, have been frequently investigated as possible angiogenic targets. CYP4X1 is a newly discovered member of Cytochrome P450 enzyme family with unknown specific function. Since, it is specifically expressed in brain and responsible for the metabolism of anandamide, makes CYP4X1 as a new plausible target for regulation of brain tumor angiogenesis. This study investigates the potential relevance of the CYP4X1 gene in brain tumor angiogenesis, using T98-G human glioblastoma multiforme cell line. CYP4X1 expression was knocked down via RNA interference (RNAi) system using Silencer Select pre-designed three independent siRNA mix, targeting CYP4X1 mRNA and scramble (negative) control siRNA. In addition, to understand the possible angiogenic effect of the CYP4X1 gene VEGF-A gene and protein expressions in T98-G cells were investigated by using q-RT PCR and Western blot techniques, respectively. Our results indicate that although VEGF-A gene expressions were significantly downregulated, protein expressions didn't change after CYP4X1 gene repression in T98-G cells. Accordingly, VEGF-A secretion which was measured with sandwich ELISA method from cell free supernatants, was significantly reduced in siRNA transfected group compared to the control group. Human umbilical endothelial vein (HUVEC) cell line was used to further investigate the effect of CYPX1 in vascular endothelial cells. No statistically significant difference was observed in HUVEC cell proliferations among the groups. In addition, in vitro angiogenesis assay was constructed by using HUVEC cells on Matrigel, and the tube length, loop formation and branching points system were evaluated by using inverted light microscope. All parameters were seemed to be reduced under CYP4X1 repression. Finally, alterations in peroxisome proliferator-activated receptor (PPARα) protein expressions were determined by using western blot technique as a possible mechanism behind CYP4X1 mediated angiogenesis. No statistically significant difference in PPARα protein expression among control and CYP4X1 siRNA treated groups was observed. Overall, the results obtained in here indicate that CYP4X1 gene is a promising alternative target for brain tumor angiogenesis. To the best of our knowledge, this thesis work is the first that investigates the possible role of CYP4X1 gene in brain tumor angiogenesis in human cell lines with siRNA mediated gene repression strategy.
Benzer Tezler
- Investigation of NFİB function and regulation of its putative target genes in human neural stem cell and SH-SY5Y neuroblastoma cell lines
İnsan sinir kök hücre ve SH-SY5Y nöroblastom hücre hatlarında NFIB işlevinin ve potansiyel hedef genlerinin regülasyonunun incelenmesi
BETÜL ULUCA
Doktora
İngilizce
2023
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ ASLI KUMBASAR
- Investigation of the effect of long non-coding RNA MEG3 expression on cancer-related behaviors of cells in glial tumors
Uzun kodlamayan RNA MEG3 ekspresyonunun glial tümörlerde hücrelerin kanserle ilgili davranışlarına etkisinin incelenmesi
ZEHRA DEĞİRMENCİ
Yüksek Lisans
İngilizce
2021
BiyolojiBahçeşehir ÜniversitesiSağlık Bilimleri Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ TİMUÇİN AVŞAR
- Izositrat dehidrogenaz (IDH) geninde mutasyon taşıyan ve taşımayan glioblastoma hücrelerinde flavopiridolün endoplazmik retikulum stresine etkisinin araştırılması
Investigation of the effect of flavopiridol on endoplasmic reticulum stress in glioblastoma cells with and without mutation in the isocitrate dehydrogenase (IDH) gene
AHSEN GÜLER
Yüksek Lisans
Türkçe
2021
Tıbbi BiyolojiErciyes ÜniversitesiTıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ZÜHAL HAMURCU
- A privileged hunter: Role of NLRP7 in immune privilege
Ayrıcalıklı bir avcı: NLRP7'nin immün ayrıcalıktaki rolü
DUYGU DEMİRÖZ
Yüksek Lisans
İngilizce
2012
Moleküler TıpBoğaziçi ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. NESRİN ÖZÖREN
- Kolorektal kanserli hastalarda TCEAL7 geninin araştırılması
Investigation of TCEAL7 gene in colorectal cancer
ELİF DARBUKA
Yüksek Lisans
Türkçe
2018
Genetikİstanbul ÜniversitesiGenetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ALİ NUR TURGUT ULUTİN