Geri Dön

Purification and kinetic and immunologic characterization of theta class qlutathione s. transferase GSTT1-1 from normal and cancerous human breast tissues

Normal ve kanserli insan meme dokularındaki teta-sınıfı glutatyon s-transferaz GSTT1'in saflaştırılması ve kinetik ve immünolojik karakterizasyonu

  1. Tez No: 82460
  2. Yazar: AWNİ ALİ ABU-HİJLEH
  3. Danışmanlar: PROF. DR. MESUDE İŞCAN
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyokimya, Biochemistry
  6. Anahtar Kelimeler: Glutatyon S-transferazler, Teta sınıfı GST'leri, Meme kanseri, Polimorfizm, Saflaştırma, Western Blot, Kinetik özellikler. vı, Glutathione ^-transferases, Theta class GSTs, Breast cancer, Polymorphism, Purification, Western blotting, Kinetic properties IV
  7. Yıl: 1999
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyokimya Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 150

Özet

oz NORMAL VE KANSERLİ İNSAN MEME DOKULARINDAKİ TETA- SINIFI GLUTATYON S-TRANSFERAZ: GSTTl-1'İN SAFLAŞTIRILMASI, VE KİNETİK VE İMMÜNOLOJİK KARAKTERİZASYONU Abu-Hijleh, Awni Ali Doktora, Biyokimya Bölümü Danışman: Prof. Dr. Mesude İşcan Ocak 1999, 150 Sayfa l-kloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB)'in ve l,2-epoksi-3-(p-nitro- fenoxi) propan (EPNP)'in sitozolik GSTler ile in vitro glutatyon konjugasyonları eşleşmiş insan normal ve tümör dokularında incelendi. Kontrol meme dokularında CDNB substratına karşı GST özgül aktivitesi 81.2 ± 71.9 nmole/dak/mg protein olarak, kanserli dokularda ise 145.0 ± 111.9 nmole/dak/mg protein olarak saptandı. EPNP substratına karşı GST özgül aktivitesi normal dokulardal9.8 ± 18.0 nmole/dak/mg protein ve tümörlü dokularda ise 27.5 ± 22.8 nmole/dâk/mg protein olarak ölçüldü. Mann- Whitney testi kontrol ve tümör gruplarındaki CDNB-GST ve EPNP-GST aktiviteleri arsındaki farkın istatistiksel olarak anlamlı olduğunu göstermiştir. Substrat CDNB 'e karşı ölçülen GST aktiviteleri 40 eş sitozolik fraksiyonda da görülmesine rağmen, sitozolik fraksiyonların %25 ( 40 numunenin 10'unda) inde substrat EPNP'e karşı aktivite görülmemiştir. EPNP'e karşı yüksek aktivite veren bir teta sınıfı enzimi olan GSTT1-1, insan kontrol meme dokularından %21 verim ve 28 kat saflaştırma faktörü ile; tümör dokularından ise % 39 verim ve 23 kat saflaştırma faktörü ile saflaştırılmıştır. Saflaştırma protokolü,sırası ile, Sephadex G-100 kolonunda jel fıltrasyonu, »S-heksillglutatyon afınite kolon kromatografisi, hızlı akışlı DEAE- Sepharose anyon değiştirici, TSK esaslı tiyofılik resin (T-jel) ve Matrex jel Oranj A boya esaslı kolonlarda kromatografi ve kromatofoküslama kolon kromatografısinden oluşmaktadır. Enzim aktivitesinin saflaştırmanın son basamağında hızla düştüğü gözlenmiştir. Normal ve tümörlü meme dokularından yapılan saflaştırmalarda kolon kromatografi profillerinde farklılık gözlenmemiştir. Saflaştırılan GSTTl-1'in denenen bir çok GST substratları arasından sadece EPNP, 4-NBC, CHP and DCM'e karşı anlamlı aktiviteler verdiği görülmüştür. Bu aktiviteler kontrol meme dokularından saflaştırılan GSTT1-1 için, sırasıyla 1540, 63, 7.2, 152 nmole/dak/mg protein ve meme tümörü dokularından saflaştırılan GSTT1-1 için sırasıyla 2170, 78, 9.3 ve 173 nmole/dak/mg protein olarak saptanmıştır. Saflaştırılmış kontrol ve tümör GSTT1-1 izozimlerinin substrat EPNP için Km değerleri sırasıyla 0.25 ve 0.33 mM olarak ve kofaktör GSH için Km değerleri ise 0.4 ve 5.0 mM olarak hesaplanmıştır. Her iki dokudan da saflaştırılmış GSTT1-1 izozimlerinin altünitelerinin molekül ağırlıklarının yaklaşık olarak 25.500 ve izoelektrik noktalarının da 6.6 civarında olduğu SDS-PAGE, EEF ve Western Blot analizleri ile gösterilmiştir. İnsan memesi normal ve kanserli dokularından saflaştırılan GSTT1-1 izozimlerinin arasında molekül ağırlıkları ve izoelektrik noktaları açısından bir farklılık olmadığı gözlenmiştir.

Özet (Çeviri)

ABSTRACT PURIFICATION, AND KINETIC AND IMMUNOLOGIC CHARACTERIZATION OF THETA CLASS GLUTATHIONE S- TRANSFERASE GSTT1-1 FROM NORMAL AND CANCEROUS HUMAN BREAST TISSUES Abu-Hijleh, Awni AH Ph.D., Department of Biochemistry Supervisor: Prof. Dr. Mesude İşcan January 1999, 150 pages The interindividual variation in the conjugation of l-chloro-2,4- dinitrobenzene (CDNB) and of l,2-epoxy-3-(p-nitrophenoxy) propane (EPNP) with glutathione (GSH) by cytosolic glutathione ^-transferases (GSTs) were investigated in human breast matched normal and tumor samples. The average specific activity against CDNB was calculated as 81.2 ± 71.9 nmole/min/mg protein for breast control GSTs, and 145.0 ± 1 1 1.9 nmole/min/mg protein for breast tumor GSTs. The average specific activity against EPNP was calculated as 19.8 ± 18.0 nmole/min/mg protein for breast control GSTs, and 27.5 ± 22.8 nmole/min/mg protein for breast tumor GSTs. Mann-Whitney test revealed that the difference between the two control and tumor groups is statistically significant with respect to the CDNB GSTs activities as well as to the EPNP GSTs activities. While GSTs activity against CDNB as a substrate was detected in all of the matched 40 cytosolic fraction, 25 % of the cytosolic fractions (10 out of 40) had no activity of GSTs against EPNP as a substrate. A class Theta GST (GSTT1-1), with high iiiactivity towards EPNP was isolated and purified from human breast in 21 % yield with a purification factor of 28-fold for normal and 39 % yield with a purification factor of 23 -fold for tumor. The purification protocol included a sequential gel filtration on Sephadex G-100 column, S-hexylglutathione agarose affinity chromatography, anion-exchange chromatography on DEAE-Sepharose fast flow column, chromatography on TSK based thiophilic resin (T-gel) and dye-ligand column chromatography on Matrex Gel Orange A and chromatofocusing column chromatography. The enzyme activity towards EPNP decreased rapidly in the last step of purification. No difference was observed between the purification profiles of the GSTT1-1 of human breast normal and tumor tissues. Amongst the several other GSTs substrates, the purified GSTT1-1 showed significant activity only against EPNP, 4-nitrobenzyl chloride (4-NBC), cumene hydroperoxide (CHP) and dichloromethane (DCM) of 1540, 63, 7.2 and 152 nmole/min/mg protein, respectively, for GSTT1-1 purified from normal breast and 2170, 78, 9.3 and 173 nmole/min/mg protein, respectively, for GSTT1-1 purified from breast tumor tissues. The Km values of the purified isoenzyme for EPNP were calculated as 0.25 and 0.33 mM for control and tumor GSTT1-1, respectively, and for GSH as 4.0 and 5.0 mM for control and tumor GSTT1-1, respectively. The GSTT1-1 purified from both tissues had a subunit molecular weight (Mr) value of about 25,500 and an isoelectric point (pi) around 6.6, as confirmed by SDS-PAGE, IEF and Western blotting analysis. No difference was observed in terms of molecular weights and isoelectric points of the purified GSTT1-1 from breast normal and tumor tissues.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    118981

    Biochemical and immunological characterization of beef liver NADPH-cytochrome P450 reductase

    Sığır karaciğer NADPH-sitokrom P450 redüktaz enziminin biyokimyasal ve immünolojik karakterizasyonu

    HAYDAR ÇELİK

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2002

    BiyokimyaOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyokimya Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. EMEL ARINÇ

  2. Tez No

    438073

    Lactococcus lactis Spp. lactis (NRRL-1821) kaynaklı dipeptidil peptidaz IV enziminin kinetik özelliklerinin belirlenmesi

    Determination of kinetic properties of dipeptidyl peptidase IV enzyme from Lactococcus lactis Spp. lactis

    SEVDA ARISOY

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2016

    BiyoteknolojiPamukkale Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. ÖZLEM AYTEKİN

  3. Tez No

    329618

    Theileria annulata'nın enolaz enzimini kodlayan genin intronsuz olarak klonlanması, enzimin ifade edilmesi, saflaştırılması ve kinetik karakterizasyonu

    Cloning of enolase gene without intron, expression, purification and kinetic characterization of the enzyme from Theileria annulata

    EBRU ÇAYIR

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2013

    BiyokimyaYıldız Teknik Üniversitesi

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. DİLEK BALIK

  4. Tez No

    882164

    Sibirya Mersin Balığı Acipenser Baerii (Brandt,1869)'un solungaç dokusu glukoz 6 fosfat dehidrojenazının (EC.1.1.1.49) saflaştırılması ve kinetik karakterizasyonu

    Purification and kinetic characterization of gill tissue glucose 6 phosphate dehydrogenase (EC.1.1.1.49) from siberian sturgeon Acipenser Baerii (Brandt, 1869)

    BEYZA GÜL KOÇAK

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    BiyokimyaSivas Cumhuriyet Üniversitesi

    Biyokimya Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. SALİH GÖRGÜN

  5. Tez No

    169050

    Ocimum basilicum L.'den elde edilen polifenol oksidaz enziminin saflaştırılması, kinetik ve elektroforetik özelliklerinin incelenmesi

    Purification and investigation of kinetic and electrophoretic properties of polyphenol oxidase enzyme obtained from Ocimum basilicum L.

    PINAR TURAN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2005

    KimyaBalıkesir Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    DOÇ.DR. MEHMET DOĞAN

    Y.DOÇ.DR. SERAP DOĞAN

Geri Dön