Bacterial cellulose production using enzymatic hydrolysate of olive pomace

Zeytin küspesinin enzimatik hidrolizatından bakteriyel selüloz üretimi

PDF İndir

Tez No: 848384
Yazar: CEREN SAĞDIÇ ÖZTAN
Danışmanlar: PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER, PROF. DR. MELEK TÜTER
Tez Türü: Doktora
Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
Yıl: 2023
Dil: İngilizce
Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
Sayfa Sayısı: 141

Özet

Bakteriyel (mikrobiyal) selüloz, bitkisel selüloz ile aynı kimyasal ve yapısal özelliklere sahip bir biyopolimerdir. Ancak, bitki kökenli muadiline kıyasla yüksek polimerizasyon derecesi, su tutma kapasitesi ve biyouyumluluk gibi üstün özellikleri nedeniyle son zamanlarda büyük bilimsel ilgi görmektedir. Ayrıca, bitkisel selüloz genellikle lignin, pektin ve hemiselüloz polimerlerine bağlı bir şekilde üretilirken, BC saf bir ürün olarak elde edilir. Bu özellikleri sayesinde bakteriyel selüloz gıda, kağıt, biyosensörler, elektronik, ilaç salım sistemleri, kozmetikler ve yara iyileştirici malzemeler gibi birçok uygulamada başarıyla kullanılmaktadır. Mikrobiyal selüloz Acetobacter, Pseudomonas, Rhizobium ve Escherichia gibi bazı bakteri cinslerinin yanı sıra bazı algler (Valonia, Chaetamorpha) ve mantarlar tarafından da oluşturulabilmektedir. Mikroorganizmaları UV radyasyonu, desikasyon ve kontaminasyon gibi çevresel faktörlere karşı koruyarak evrimsel bir avantaj sağladığı düşünülmektedir. Bakteriyel selüloz üretimi için çeşitli standartlaştırılmış besi ortamları bulunmaktadır. Bununla birlikte, bu yüksek saflıktaki bileşenlerin maliyeti, bakteriyel selülozun büyük ölçekli kullanımını engellemektedir. Şimdiye kadar, besi yeri maliyetini en aza indirmek için çok sayıda strateji önerilmiştir. Melas, çürümüş meyve, portakal kabuğu bakteriyel selüloz üretimi için umut verici sonuçlar veren alternatif besiyerleri arasında sayılabilir. Bu çalışmada, zeytin posasındaki lignoselülozik materyalin bakteriyel selüloz üretimi için karbon kaynağı olarak kullanımı gerçekleştirilmiştir. Dünyada en bol bulunan biyopolimer olan lignoselüloz, fosil yakıtlara ikame olarak büyük bir potansiyele sahiptir. Günümüzde mikroorganizmalar aracılığıyla lignoselülozdan biyoetanol ve biyoyakıt üretimi endüstride yaygın olarak uygulanmaktadır. Mevcut çalışmada da benzer şekilde, lignoselülozdan monomerik şekerlerin elde edilmesi ve bu şekerlerin selüloz üreten Novacetimonas hansenii bakterisi için karbon kaynağı olarak kullanılması amaçlanmıştır. Zeytin küspesi, zeytinyağı endüstrisinin bir yan ürünüdür; zeytin posası, çekirdekleri ve meyve kabuğundan oluşur. Atık uygun şekilde yönetilmediği takdirde çevresel sorunlara yol açabilir. Yağ üretimi sırasında 100 kg zeytinden yaklaşık 35 - 45 kg kuru küspe elde edilir. Bu materyal genellikle enerji üretimi için ayrıştırılır ve yakılır. Bununla birlikte, yüksek lignoselülozik içeriği ile, küspenin değerlendirilmesi için daha verimli bir yola ihtiyaç duyulduğu da aşikardır. Çalışmanın ilk bölümünde, iki suş selüloz üretim verimlerine göre karşılaştırılmıştır. Buna ek olarak, en etkili yöntemi belirlemek için çeşitli yetiştirme koşulları denenmiştir. Statik koşulda N. hansenii (ATCC 53582) en iyi sonuçları verdiğinden sonraki adımlarda bahsi geçen suş statik koşullarda üretilmiştir. Ayrıca, üç tarımsal atık; et-kemik unu, balık unu ve zeytin küspesi, besi ortamı olarak işlev görme etkinlikleri açısından araştırılmıştır. Et-kemik unu ve balık unu ortamlarında hiç selüloz oluşmazken, küspe ve laktoz ile hazırlanan besi yerinde az miktarda selüloz elde edilmiştir. Daha sonra, karbon kaynağı olarak laktoz ve glikozun performansı incelenirken azot kaynağı olarak küspe kullanımıyla birkaç deneme gerçekleştirilmiştir. Ancak, elementer analizler zeytin küspesi azot içeriğinin küspeyi besi ortamında azot kaynağı olarak kullanılmak için yeterli olmadığını ortaya koymuştur. Ayrıca, küspede üretilen selüloz mekanik olarak çok zayıf olması herhangi ileri bir uygulama için kullanımına el vermemektedir. Öte yandan, zeytin küspesinin yaklaşık % 45 karbon içeriği ile yüksek organik bileşene sahip olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, çalışmanın ikinci bölümünde, zeytin küspesindeki lignoselülozunun parçalanması yoluyla monomerik şeker üretilmesi amaçlanmıştır. Bunun için sırasıyla asidik ön işlem ve enzimatik hidroliz uygulanmıştır. Asidik ön işlem, selüloz ve hemiselülozu enzimatik hidrolizin daha verimli olabilmesi için kompleks halde bulunan selüloz, hemiselüloz ve lignin yapılarını birbirinden ayırmayı amaçlar. Sonrasında uygulanan enzimatik hidroliz, mikroorganizmalar tarafından kullanılabilen monomerik şekerlerin açığa çıkmasını sağlar. Bu çalışmada, selülozu hemiselüloz ve ligninden ayırmak, böylece hidrolize edilebilir uçları serbest bırakmak ve oligosakkaritleri açığa çıkarmak için zeytin küspesi 170 oC'de 8 barda % 1 fosforik asit ile ön işleme tabi tutulmuştur. Daha sonra enzimatik reaksiyon, statik ve çalkalamalı koşullarda % 1.5 ila 30 (w/w) arasında değişen enzim:substrat konsantrasyonları ile 72 saat boyunca 50 oC'de gerçekleştirilmiştir. Asidik ön muameleyi takiben sıvı kısmın indirgen şeker konsantrasyonu glukoz hekzokinaz testi ile belirlenmiş ve herhangi bir mikrobiyal büyümeye yol açmayacak kadar düşük bulunmuştur. Her bir enzimatik hidrolizatın indirgen şeker konsantrasyonu dinitrosalisilik asit (DNSA) yöntemi ile tespit edilmiştir. Değişen enzim:substrat konsantrasyonları arasında, statik koşullarda % 30 enzim konsantrasyonu 9.31 g/l ile en yüksek indirgen şeker verimi ile sonuçlanmıştır. Enzimatik hidrolizatlar galaktoz, glukoz, mannoz, arabinoz, ksiloz, ramnoz, laktoz, fruktoz, maltoz ve selobiyoz varlığı açısından HPLC ile taranmış ve bu şekerlerin farklı hidrolizatlardaki dağılımı belirlenmiştir. Her hidrolizatta glukozun en yüksek miktardaki monosakkarit olduğu bulunmuştur. Seçilen hidrolizatlardan karbon kaynağı hariç Hestrin-Schramm bileşenleri ile besiyeri hazırlanmış, ancak selüloz oluşumu gözlenmemiştir. Bu nedenle, hidrolizatlar ön işlem sırasında oluşan inhibitörleri gidermek için detoksifiye edilmiştir. Denenen yöntemler arasında Ca(OH)2 muamelesinin en etkili yöntem olduğu gösterilmiştir. Detoksifiye edeilen hidrolizatlarla hazırlanan besiyerinde en yüksek bakteriyel selüloz üretimi miktarı 0.68 g/l olmuştur. Ayrıca, Hestrin-Schramm besiyeri ile enzimatik hidrolizattan hazırlanan besiyeri substrat dönüşüm oranı, selüloz üretim oranı ve verim açısından karşılaştırılmıştır. Kontrol ve test ortamlarındaki şeker tüketimi HPLC ile tespit edilmiştir. Çalışmanın üçüncü bölümünde, alternatif ortamda üretilen bakteriyel selüloz, X-ışını Kırınım Analizi, Fourier-Transform Kızılötesi Spektroskopisi (FTIR) ve Taramalı Elektron Mikroskopisi (SEM) ile karakterize edilmiştir. X-ışını kırınımı, yeni bakteriyel selülozun tipik selüloz I piklerine sahip olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, yeni selülozda difratogramda HAP sinyallerine neden olan az miktarda fosfat tuzu varlığı tespit edilmiştir. FTIR analizi, yeni bakteriyel selülozun karakteristik spektrumuna sahip olduğunu ve safsızlık içermediğini göstermiştir. Benzer şekilde, SEM analizi ile yeni malzemenin kontrol malzemesine çok benzer nano boyutlu fibriler yapıya sahip olduğu kanıtlanmıştır.

Özet (Çeviri)

Bacterial cellulose is a biopolymer which has the identical chemical and structural properties with plant cellulose. However, it is recently of great scientific interest due to its superior characteristics such as high degree of polymerization, water retention capacity, and biocompatibility, compared to its plant-originated counterpart. Additionally, while plant cellulose is often bound to lignin, pectin and hemicellulose polymers, BC is obtained as a pure product. By virtue of these features, bacterial cellulose has been successfully employed in many applications among which are food, paper, biosensors, electronics, drug delivery systems, cosmetics, and wound healing materials. Along with some bacteria genera such as Acetobacter, Pseudomonas, Rhizobium and Escherichia, this polymer can also be formed by some algae (Valonia, Chaetamorpha) and fungi. It has been considered to procure the microorganisms an evolutionary advantage by protecting them against environmental factors such as UV radiation, desiccation and, contamination. There are several standardized growth media for the production of bacterial cellulose. Nonetheless, high cost of these laboratory-grade ingredients obstructs the large scale use of bacterial cellulose. Heretofore, numerous strategies have been proposed to minimize the medium cost. Molasses, rotten fruit, orange peel can be counted among the alternative media which gave promising results for bacterial cellulose generation. In this study, use of lignocellulosic material, particularly of olive pomace as carbon source for bacterial cellulose production was demonstrated. Lignocellulose, being the most abundant biopolymer in the world, has a great potential to serve as a substitute for fossil fuels. In fact, bioethanol and biofuel generation from lignocellulose by means of microorganims has been widely applied in industry. Similarly, in this work, it was aimed to obtain monomeric sugars from lignocellulose which in turn was used as carbon source for the cellulose producing bacteria- Novacetimonas hansenii. On the other hand, olive pomace (OP) is a by-product of the olive oil industry. Olive pomace is made up of olive pulp, stones, and skin of the fruit. It may pose environmental problems if not conducted properly. Approximately 35 - 45 kg dry olive pomace is obtained from 100 kg olive during oil production. This material is generally sorted and burned for energy production Nevertheless, it has been shown that OP is high in lignocellulosic content and the need for a more efficient way to use this material is apparent. In the first part of the study, two strains were compared according to their cellulose production yields. In addition, several cultivation conditions were performed to determine the most effective method. N. hansenii (ATCC 53582) in static growth condition gave the best results and therefore applied on the next steps. Moreover, three agricultural waste products; meat-bone flour, fish flour, and olive pomace were investigated for their efficiency to function as growth media. While no cellulose was formed with meat-bone flour and fish flour media, little cellulose was obtained in the medium prepared with olive pomace and lactose. After that, several trials with the use of olive pomace as nitrogen source while examining the performance of lactose and glucose as carbon sources were realized. However, elementary analysis revealed that the nitrogen content of olive pomace was not sufficient to supply the growth medium as nitrogen source. Besides, cellulose produced in olive pomace medium had poor mechanical qualities which is not suitable for any further application. On the other hand, olive pomace was shown to possess high organic component with approximately 45 % carbon. Therefore, in the second part of the study, generation of monomeric sugars by degradation of the lignocellulose of olive pomace was aimed. For this, acidic pretreatment and enzymatic hydrolysis were applied respectively. Acidic pretreatment breaks down the complex organization of lignocellulosic material to expose cellulose and hemicellulose for enzymatic degeneration. Subsequent enzymatic hydrolysis generates monomeric sugars which can be used by microorganisms. In this study, olive pomace was pretreated with 1 % phosphoric acid at 170 oC at 8 bar in order to separate cellulose from hemicellulose and lignin, thus unveiling the hydrolysable ends and producing oligosaccharides. Consecutive enzymatic reaction was conducted at 50 oC for 72 h with enzyme:substrate concentrations varying from 1.5 to 30 % (w/w) in static and agitated conditions. The reducing sugar concentration of the liquid part following the acidic pretreatment was determined by glucose hexokinase assay and found to be too low to lead to any microbial growth. Furthermore, reducing sugar concentration of each enzymatic hydrolysate was detected by dinitrosalicylic acid (DNSA) assay. Among varying enzyme:substrate concentrations, 30 % enzyme reaction in static condition resulted in the highest reducing sugar yield with 9.31 g/l. Enzymatic hydrolysates were scanned for the presence of galactose, glucose, mannose, arabinose, xylose, rhamnose, lactose, fructose, maltose and cellobiose by HPLC and distribution of these sugars along different hydrolysates was determined. For each hydrolysate, glucose was found to be the major monosaccharide. Growth media were prepared from selected hydrolysates with the ingredients of Hestrin-Schramm medium, except the carbon source, however, no cellulose formed. Therefore, the hydrolysates were detoxified to eliminate the inhibitory molecules generated in course of pretreatment. Among the methods attempted, Ca(OH)2 treatment was shown to be the most effective. From the media prepared with detoxified hydrolysates, the highest amount of bacterial cellulose production was 0.68 g/l. In addition, Hestrin-Schramm conventional medium and the medium with enzymatic hydrolysates were compared according to the substrate conversion ratio, cellulose production rate and yield. Sugar consumption in the control and test media was also detected. In the third part of the study, bacterial cellulose produced in the alternative medium was characterized with X-ray Diffraction Analysis, Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FTIR), and Scanning Electron Microscopy (SEM). X-ray diffraction demonstrated that the new BC posssesed the typical cellulose I peaks. However, the BC had a small amount of phosphate salts which caused HAP signals on the diffratogram. The FTIR analysis showed that the new bacterial cellulose had the characteristic spectrum of cellulose and no impurities were found. Similarly, with SEM analysis, it was demonstrated that the new material had nano-sized fibrillary structure very similar to the control material.

Benzer Tezler

Tez No
631063
Succinic acid production from lignocellulosic biomass by Actinobacillus succinogenes
Actinobacillus succinogenes ile lignoselülozik biyokütleden süksinik asit üretimi
GÜLPERİ KARANFİL
Yüksek Lisans
İngilizce
2021
Gıda Mühendisliği İzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü
Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ ALİ OĞUZ BÜYÜKKİLECİ
Tez No
502777
Determination of extracellular hydrolytic enzyme capabilities of some anoxybacillus isolated from hot spring environments
Kaplıcalardan izole edilen bazı anoksibasillerin ekstrasellüler hidrolitik enzim kapasitelerinin belirlenmesi
WIDAD HASSAN YARWAIS JAF
Yüksek Lisans
İngilizce
2017
Biyoloji Siirt Üniversitesi
Biyoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. MEHMET EMRE EREZ
Tez No
693860
Gıda ürünlerinde mikrobiyal bozulmaya neden olan Pseudeomonas spp. bakterisinin yüzey plazmon rezonans (SPR) temelli biyosensör kullanılarak belirlenmesi
Determination of Pseudomonas spp bacteria that cause microbial deterioration in food products using surface plasmone resonance (SPR) based biosensors
TUĞÇE YILMAZ
Yüksek Lisans
Türkçe
2021
Biyomühendislik Hacettepe Üniversitesi
Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ADİL DENİZLİ
Tez No
619637
Kök kanseri hastalığı [Rhizobium radiobacter (Agrobacterium tumefaciens)] ile mücadelede biyoajan bakterilerin kullanım imkânlarının araştırılması
Investigation of possibility of biological control with crown gall [Rhizobium radiobacter (Agrobacterium tumefaciens)] using bioagent bacteria
NASİBE TEKİNER
Doktora
Türkçe
2020
Ziraat Atatürk Üniversitesi
Bitki Koruma Ana Bilim Dalı
PROF. DR. RECEP KOTAN
Tez No
902370
Komagataeibacter rhaeticus kullanılarak nanoparçacık katkılı bakteriyel selüloz üretimi ve karakterizasyonu
Production and characterization of nanoparticle induced bacterial cellulose using komagataeibacter rhaeticus
CEYDA UĞUREL
Doktora
Türkçe
2024
Biyomühendislik Bursa Teknik Üniversitesi
Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. HAMDİ ÖĞÜT

Geri Dön