Geri Dön

Genomic analysis of sulfur dioxide-stress-resistant Saccharomyces cerevisiae

Sülfür dioksit stresine dirençli Saccharomyces cerevisiae'nin genomik analizi

  1. Tez No: 961403
  2. Yazar: ZEYNEP BAŞAK CANBAY
  3. Danışmanlar: PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Biotechnology, Genetics
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2025
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 75

Özet

Saccharomyces cerevisiae, tek hücreli ökaryotik bir mikroorganizma olup tomurcuklanan bir maya türüdür. S. cerevisiae, fırıncılık, alkol fermantasyonu, biyoyakıt ve rekombinant protein üretimi gibi birçok endüstriyel süreçte yaygın olarak kullanılır. Aynı zamanda ökaryotik bir mikroorganizma olduğu için insan dahil olmak üzere daha yüksek ökaryotik organizmaların karmaşık biyolojik süreçlerini anlamak için temel araştırmalarda model organizma olarak da kullanılır. Sülfit (SO-23), hücrede bir SO2 formudur ve sülfat asimilasyon yolunda üretilen doğal bir ara maddedir. Moleküler SO2 ve HSO-3 (bisülfit), hücrede farklı pH değişikliklerine neden olan diğer SO2 formlarıdır. SO2, ATP üretimini katalize eden Gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH) ve ATPaz gibi enzimlerin aktivitesini inhibe edebilir veya indirgeyici yapısı nedeniyle disülfür bağlarının kırılmasına neden olabilir. SO2, pH düşürücü ve ATPaz inhibisyonu gibi etkilerinden dolayı asit ve oksidatif stres mekanizmalarını aktive ederek canlılığı etkilemektedir. Stres oluşturucu özelliklerinin yanı sıra SO2, sahip olduğu antioksidan ve antimikrobiyal özellikleri sayesinde de gıda sektöründe koruyucu olarak tercih edilen bir molekül olmuştur. Şarap üretiminde önemli bir rolü olan maya hücrelerinin, günümüze dek bu moleküle farklı endüstriyel alanlarda doğal seçilim ile direnç kazandığı gözlemlenmiştir. Bu nedenle endüstride kullanılan S. cerevisiae suşları için SO2 direncinin geliştirilmesi önemlidir. S. cerevisiae, tüm genom dizilemesi yapılmış ve sahip olduğu avantaj niteliği taşıyan özellikleriyle güvenle kullanılan bir mayadır. Bunun yanı sıra, farklı stres koşullarına karşı geliştirebildiği direnç mekanizmaları ile sanayide ya da gıda endüstrisinde kullanılırken çeşitli stresli koşullara kolayca adapte olabilir. Bu sebeple, SO2 stresine dirençli S. cerevisiae suşları, şarap üretimi ve fırıncılık gibi farklı sektörlerde güvenle kullanılabilecek ve tüketicilerin beslenme ihtiyacını karşılamakta yardımcı olacaktır. S. cerevisiae mayasını kullanarak gerçekleştirilen endüstriyel üretim süreçlerinin verimliliğinin arttırılması için bu mayanın stres faktörlerine karşı direnç kazanması ve istenilen ürünlerin üretimini tetikleyici metabolik yolakların aktivasyonu gerekmektedir. Metabolik mühendislik, bu hedefe yönelik uygun bir yaklaşım olup, rekombinant DNA teknolojisinden yararlanarak hücrelerin düzenleyici ve enzimatik fonksiyonlarının dinamiğini değiştirir ve aktivitelerini arttırır. Rasyonel metabolik mühendislik yardımıyla bu iyileştirmeyi gerçekleştirmek için metabolik yolaklarda etkili olan genler hakkında bilgi sahibi olmak gerekmektedir, fakat bu bilgi gereksinimi her zaman karşılanamayabilir. Tersine metabolik mühendislik, rasyonel metabolik mühendisliğin gerektirdiği bu ekstra bilgi ihtiyacını karşılamadan da istenilen endüstriyel mikroorganizma üretimini sağlamak için geliştirilmiş alternatif bir yaklaşımdır. Tersine metabolik mühendislik için ilk adım olarak istenilen fenotipteki mikroorganizmanın eldesi veya izolasyonu sağlanır. İkinci adım olarak da bu fenotipe sebep olan gen düzeyindeki değişimler tespit edilir. Üçüncü adımda ise, tespit edilen genlere bağlı kalarak bu genlerin mutasyonu gerçekleştirilir ya da mutasyonlu gen, üretim için uygun olan bir endüstriyel mikroorganizmaya aktarılır. Bir tersine metabolik mühendislik stratejisi olan evrimsel mühendislik ise, genellikle mikroorganizmaların bir substratı daha verimli kullanmalarını sağlayarak ürün üretimini arttırma ya da onlara çeşitli stres faktörlerine karşı direnç kazandırmak amaçlarıyla uygulanan bir yaklaşımdır. Bu yaklaşımda istenilen fenotipteki mikroorganizma, laboratuvar koşullarında mutasyon ve seleksiyon döngüleriyle sistematik olarak elde edilir. Bu amaçla maya hücreleri direnç kazanılması istenilen strese maruz bırakılır. Strese dirençli mayaların hayatta kalmasına neden olan gen mutasyonları nesilden nesile aktarılır ve en son aşamada strese dirençli mikroorganizmalar seçilir. Dirençli mutant maya bireylerinin seçilimi ile birlikte tersine metabolik mühendisliğin ikinci adımının gerektirdiği gen düzeyindeki değişimlerin tespiti yapılır. Bunun için yeni nesil DNA dizileme yöntemi kullanılarak referans suşun genomunun dirençli suş genomuyla hizalanması yapılır ve iki genom verisi kıyaslanır. Bu kıyaslamayla dirençli bireyin genomunda olup referans genomda olmayan mutasyonlar, direnç kazanımında rol oynayabilme potansiyellerinden ötürü değerlendirilir. Yeni nesil DNA dizileme, DNA dizisi hakkında hızlı bir veri eldesi için diğer dizileme yöntemlerine kıyasla daha avantajlı olan güncel bir yöntemdir ve genetik karakterizasyon ve fonksiyonel genomik çalışmalar için genellikle bu yöntemden yararlanılır. SO2 stresine karşı dirençli bir S. cerevisiae maya suşu, önceki çalışmalarda evrimsel mühendislik yaklaşımıyla elde edilmiştir. Literatürde, SO2 stresinin S. cerevisiae maya suşlarında araştırıldığı bazı çalışmalar bulunmaktadır. Bunlardan birinde SO2 stresine dirençli S. cerevisiae suşunda SSU1-R (sülfit direnci geni) ifadesi için gerekli olan kromozomal yeniden düzenleme araştırılmış ve Fzf1 transkripsiyon faktörünün bu gen üzerindeki etkisi incelenmiştir. Diğer bir çalışmada ise S. cerevisiae ∆com2 mutantı kullanılarak spot tahlili yöntemiyle Com2 transkripsiyon faktörünün SO2 direncini sağlamak için SO2 ile aktive olan genlerin %80'inin ekspresyonunu kontrol ettiği tespit edilmiştir (Lage, 2019). Bu çalışmanın amacı, bir tersine metabolik mühendislik yaklaşımı olan evrimsel mühendislik yöntemi ve kimyasal bir mutajen olan etil metansülfonat (EMS) kullanılarak elde edilen SO2 stresine dirençli bir S. cerevisiae maya suşunun, SO2 stresine dirençli olmasına neden olabilecek moleküler faktörleri karşılaştırmalı genomik analiz ile belirlemektir. Bu amaçla gerçekleştirilmiş olan karşılaştırmalı SO2-dirençli maya suşunda genomik analiz sonuçları, sülfit taşınımı ve otofaji ile ilişkili genler olan ATG14, SSU1 ve FZF1 genlerinde mutasyonlar olduğunu ve bu genlerin S. cerevisiae'nin SO2 direncinde önemli rol oynayabileceğini göstermiştir. Ayrıca, hücre duvarı biyosentezinde görev alan DCW1 geninde tespit edilen mutasyon ve SO2-dirençli suşun, referans suşa kıyasla, litikaz duyarlılık testi sonuçlarına göre daha yüksek hücre duvarı bütünlüğüne sahip olması, hücre duvarı bütünlüğünün de S. cerevisiae'nin SO2-direncinde önemli olabileceğini göstermiştir. Tespit edilen gen mutasyonlarının, SO2-direncindeki potansiyel rolünün tersine mühendislik ve genom düzenleme çalışmalarıyla doğrulanması gerekmektedir.

Özet (Çeviri)

Saccharomyces cerevisiae, a single-celled eukaryotic microorganism, is a budding yeast species. It is widely used as a preferred microorganism in many industrial processes such as baking, alcohol fermentation, biofuel and recombinant protein production, and in basic research to understand the complex biological processes of higher eukaryotic organisms, including humans, as it is a eukaryotic model organism. Sulfite (SO-23) is a form of SO2 in the cell and is a natural intermediate produced in the sulfate assimilation pathway. Molecular SO2 and HSO-3 (bisulfite) are other forms of SO2 that cause different pH changes in the cell. SO2 can inhibit the activity of enzymes such as Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and ATPase, which catalyze ATP production, or can cause disulfide bonds to break due to its reducing nature. Due to its effects such as pH decrease and ATPase inhibition, SO2 affects viability by activating acid and oxidative stress mechanisms. For this reason, developing SO2 resistance is important for S. cerevisiae strains used in industry. Despite its stress-inducing properties, SO2 is a molecule preferred in the food industry for protective purposes, due to its antioxidant and antimicrobial properties. Yeast cells, which have an important role in wine production, have been observed to gain resistance to this molecule through natural selection in different industrial areas to date. S. cerevisiae is a yeast the entire genome of which has been sequenced. S.cerevisiae is used safely due to its advantageous features. In addition, it can easily adapt to diverse stressful environments when used in the industry or food industry, with the resistance mechanisms it can develop against different stress conditions. For this reason, S. cerevisiae yeast strains that are resistant to SO2 stress can be used safely in different industrial applications such as wine production and baking, and will help meet the nutritional needs of the customers. A S. cerevisiae strain resistant to SO2 stress was obtained previously by evolutionary engineering. There are previous studies in the literature investigating SO2 stress in S. cerevisiae yeast strains. In one of these, the chromosomal rearrangement required for the expression of SSU1-R (sulfide resistance gene) in the SO2-resistant S. cerevisiae strain was investigated and the effect of Fzf1 transcription factor on this gene was examined. The aim of this study was to identify the genetic changes underlying the SO2-resistance of an evolved S. cerevisiae strain previously obtained by random mutagenesis by the chemical mutagen ethyl methanesulfonate (EMS) followed by evolutionary engineering. A comparative genomic analysis was conducted to elucidate the genetic factors contributing to the acquired SO2-resistance. Lyticase sensitivity assay was also employed to determine whether the acquisition of SO2 resistance changed the cell wall integrity, by comparing the results with that of the reference strain. The results revealed that the mutations identified in the ATG8, SSU1 and FZF1 genes that are related to sulfite transport and autophagy may play a key role in the SO2-resistance of S. cerevisiae. In addition, the mutation observed in the DCW1 gene that is involved in cell wall biosynthesis and the higher cell wall integrity of the evolved strain than the reference strain indicated that the increased cell wall integrity may also play a key role in the SO2-resistance of S. cerevisiae. The potential role of the identified gene mutations in SO2- resistance should be verified with reverse engineering and genome editing studies as a future work.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    747003

    Engelli bireylerde K. pneumoniae ve E. coli izolatlarının karbapenem direncinin analizi

    Analysis of carbapenem resistance of K. pneumoniae and E. coli isolates in people with disabilities

    MEHMET SALİH CEYLAN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    Eczacılık ve FarmakolojiVan Yüzüncü Yıl Üniversitesi

    Temel Eczacılık Bilimleri Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. GÜLHAN BORA

  2. Tez No

    310458

    Construction of pre-enriched metagenomic libraries for isolating novel hydrolase enzymes for liquid/supercritical CO2

    Sıvı/superkritik CO2 ortamına uygun yeni hidrolaz enzimlerinin izolasyonu için ön-zenginleştirme uygulanmış metagenomik kütüphane kurulması

    HAVVA ESRA BIYIK

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2011

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER

  3. Tez No

    550037

    Farklı coğrafik bölgelere ait çok ilaca dirençli Mycobacterium tuberculosis izolatlarının karşılaştırmalı genom analizi

    Comparative genome analysis of the multidrug resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from different geographic regions

    SERDAR ULAŞ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    BiyolojiÇankırı Karatekin Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. SEZER OKAY

  4. Tez No

    453494

    Molecular cloning, sequencing and transcriptional analyses of the genes coding for 5-aminolevulinic acid synthase isoenzymes in Rhodobacter sphaeroides O.U.001

    Rhodobacter sphaeroıdes O.U.001'de bulunan 5-aminolevulinik asit sentaz izoenzimlerini kodlayan genlerin klonlanması, dizilenmesi ve transkipsiyonel analizleri

    MARWA HASSAN JAWAD JAWAD

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    BiyolojiSelçuk Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. GIYASETTİN KAŞIK

  5. Tez No

    482599

    Determination of the extracellular hydrolytic enzyme prduction capabilities of Acidithiobacillus bacteria isolated from Awa Sppi river in Sulaymaniyah, Iraq and 16S rDNA analysis

    Irak Süleymaniye'deki Awa Sppi nehrinden izole edilen Acidithiobacillus cinse bakterilerin ektraselüler hidrolitik enzim üretme kabiliyetlerinin belirlenmesi ve 16S rRNA analizi

    GHALIB ABDALLA SHARIF

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    MikrobiyolojiYüzüncü Yıl Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. KEREM ÖZDEMİR

Geri Dön