FT-IR and CD studies on fragmentation of proteins by proteases
Proteinlerin proteazlarla parçalanması üzerine FT-IR ve CD çalışmaları
- Tez No: 887089
- Danışmanlar: PROF. DR. WERNER MAENTELE
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyofizik, Biophysics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2010
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Goethe-Universität Frankfurt am Main
- Enstitü: Yurtdışı Enstitü
- Ana Bilim Dalı: Fizik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Biyofizik Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 135
Özet
Proteoliz, sindirim ve beslenme süreçlerinde gıda proteinlerinin bozunmasına neden olur. Ancak, peptid bağı üzerindeki enzim özgüllüğünün karmaşıklığı henüz çözülmüş olmaktan çok uzaktır ve proteoliz sırasında proteinlerin serbest kalan modellerini ve proteinlerin ikincil yapı değişikliklerini anlamak henüz net değildir. Bu çalışmada substrat olarak kullanılan üç proteinin (BSA, β-laktoglobulin ve β-kazein) proteoliz sırasındaki konformasyonel değişiklikleri incelenmiştir. Bu amaçla, substratları sindirmek için çeşitli konsantrasyonlarda proteaz enzimleri olarak trypsin ve α-kimotripsin kullanılmıştır. Böylece, bu tür proteinlerin enzimatik kaynaklı bozunması tespit edilmiştir. Bu tezde, Fourier Dönüşümü Kızılötesi Spektroskopisi (FT-IR) ve Dairesel Dikroizm Spektroskopisi (CD), yapısal değişiklikleri incelemek ve enzimatik reaksiyonların sonuçlarını doğrulamak üzere kullanılmıştır. FTIR spektroskopisi ile incelenen BSA'nın sıcaklık profili, açılma durumunun 60 oC'nin üzerinde ilerlediğini ve ardından protein toplanmasının başladığını ortaya çıkardı. Katlanmış ve açılmış durum arasındaki geçiş sıcaklığı 68,4 oC olarak bulunmuştur. Dolayısıyla bu özellik 37 oC çalışma sıcaklığımızda proteoliz sürecini etkilemez. Sığır serum albüminin D2O tamponunda 37 oC'de trypsin ve α-kimotripsin ile sindirimi gerçekleştirildi. FTIR çalışmalarında, doğal BSA'nın D2O çözeltisinde %68 α-heliks, %20 β-yaprak/uzatılmış, %12 β-dönüşüne sahip olduğu, oysa 10:1 oranında α-kimotripsin ile sindirilmiş BSA'nın (daha sert proteoliz koşulu) olduğu bulunmuştur. 5 saatlik proteolizden sonra %32 α-sarmal, %17 β-yaprak, %18 β-dönüşü ve %33 rastgele sarmal yapısı sergiledi. En önemli spektral değişiklikler tüm substrat ve enzim oranları için amid I ve amid II bölgelerinde meydana geldiği görülmektedir. CD çalışmalarında, boş BSA %65 α-sarmal, %4 β-yaprak, %10 β-turn ve %22 rastgele sarmaldan oluşurken, 5 saatlik hidrolizden sonra 10:1 oranında kimotriptik sindirilmiş BSA %30 α-sarmal, %17 β-yaprak/extended, %21 β-dönüşü ve %32 rastgele sarmaldan yapısından oluşur. CD ve FTIR çalışmaları ile ikincil yapısal elementlerdeki değişikliklerin tahmini analizine göre, α-helikslerin içeriğinin güçlü bir şekilde azalırken, dönüşlerin ve rastgele sarmal yapıların, serbest karboksilatların salınımıyla (~1593 cm-1'de absorbans) eş zamanlı olarak arttığını göstermektedir (peptit bağlarının bölünmesi nedeniyle). Erişilebilir α-helikslerin enzim tarafından sindirildiği ve bozulmuş veya kısa helikslere (kısa parçalar) dönüştürüldüğü ve son olarak serbest kalan serbest karboksilat gruplarının bir proteoliz ürünü olarak ortaya çıktığı yorumu yapılabilir. Dolayısıyla her iki spektroskopi sonuçları enzimatik olarak indüklenen ikincil yapısal değişiklikleri doğrulamak konusunda uyum içindedir. Ayrıca, BSA'nın ikincil yapısal elemanlarının enzimatik parçalanmasının, enzim miktarı arttıkça daha görünür hale geldiği ve BSA'nın daha fazla bozulmasına neden olduğu sonucuna varılmıştır. Tripsin ağırlıklı olarak bozulmamış proteinin hidrofilik kısmını (lizin ve arginin polar gruplarından) ayırdığından ve α-kimotripsin, aromatik ve büyük hidrofobik kalıntılardan (tirozin, triptofan, fenilalanin, metiyonin ve lösin) substratı olumsuz şekilde hidrolize ettiğinden, BSA'nın bozulması Tripsin'de α-kimotripsin'e göre daha az etkilenir. Bu nedenle, düşük bir α-kimotripsin konsantrasyonu bile (E:S = 50:1 oranı), dönüşlerde ve rastgele sarmallarda bir artışla birlikte BSA'nın α-sarmal yapısının içeriğinde güçlü bir azalmaya neden olmuştur. β-laktoglobulinin sıcaklık profili, 1678 cm-1 bandında termal olarak indüklenen değişikliklerin, 50-66 oC arasında (faz 1) ve 66 oC'nin üzerinde (faz 2) olmak üzere iki aşamada meydana geldiğini gösterdi. Faz 1, proteinin monomerizasyonunu sergiler, bu da proteinin iki monomeri arasında bir temas olduğunu gösterir. Faz 2, yüksek sıcaklıklarda β-Lg'nin açılma durumunu gösterir. 1632 cm-1 sıcaklık profili ayrıca açılma durumunun 66 oC'nin üzerinde başladığını ortaya koymaktadır. β-laktoglobulinin 37 oC'de D2O tamponunda trypsin ile hidrolizi FTIR ve CD spektroskopileri kullanılarak gerçekleştirildi. FTIR çalışmaları, doğal β-Lg'nin %53 β-yaprak, %18 β-dönüşü ve %29 α-sarmal+rastgele sarmal içerdiğini, ancak 5 saatlik proteolizden sonra 10:1 oranında trypsin ile sindirilmiş β-Lg'nin %24 β-yaprak, %21 β-dönüşü, %55 α-sarmal+rastgele sarmal yapısına sahip olduğunu ortaya çıkardı. Ayrıca sindirilmiş proteinin FTIR spektrumunda, 1593 cm-1 ve 1406 cm-1 bantlarının yoğunluğu, proteoliz ürünleri olarak sırasıyla serbest karboksilatların antisimetrik ve simetrik gerilmesine atfedilen artışlardır. CD çalışmalarına göre, doğal β-Lg'nin %42'si β-yaprağı, %22'si β-dönüşü, %7'si α-sarmal ve %28'i rastgele sarmal yapısından oluşurken, ancak 5 saatlik proteolizden sonra 10:1 oranında triptik sindirilmiş β-Lg'nin 24% β-tabaka, %16 β-dönüş, %5 α-sarmal ve %54 rastgele sarmal yapılardan oluştuğu ortaya çıkmaktadır. Böylece, her iki spektroskopinin sonuçları, sırasız yapılarda paralel bir artışla β-yaprak içeriğinin marjinal olarak azaldığını ve sindirim sırasında β-Lg'nin daha küçük parçalara ayrılmasına neden olduğunu açıkça ortaya koymaktadır. Ayrıca 10:1 ve 50:1 oranlarının (S:E) β-Lg'yi çok yakın bir kuvvetle bozduğu ancak 10:1 oranının sindirim sırasında 50:1 oranına göre daha fazla ürün indüklediği ortaya konmuştur. Bu, peptit bağlarının trypsine erişilebilirliği ve β-Lg'nin yapısal stabilitesi ile ilişkili olabilir. FTIR spektroskopisi ile gerçekleştirilen β-kazeinin sıcaklık profili, sıcaklığın yükseltilmesiyle açılmadan bazı yapısal değişikliklerin meydana geldiğini, ancak bu sürekli değişikliklerin 90 oC'ye kadar geri dönüşümlü olduğunu gösterdi. Ayrıca 1640 cm-1 bandının (rastgele sarmal yapılar) 90 oC'ye kadar 1646 cm-1'e doğru kayması, poliprolin II yapısının sulu ortamdan daha hidrofobik ortama doğru hareket ettiğini düşündürmektedir. β-kazeinin 37 oC'de D2O tamponunda trypsin ile parçalanması FTIR ve CD spektroskopileri ile gerçekleştirildi. FTIR çalışmalarına göre, doğal β-kazeinin %20 β-yaprak, %28 β-dönüş, %16 α-heliks ve %36 rastgele sarmal içerdiği, buna karşın 4 saatlik proteolizden sonra 10:1 oranında trypsin ile parçalanmış β-kazeinin %20 β-yaprak, %27 β-dönüş, %14 α-sarmal ve %39 rastgele sarmal yapı içerdiği bulunmuştur. Dikkat çekici bir şekilde, sindirilmiş proteinin α-sarmal içeriği t = 5 dakikada yalnızca %8'dir. CD çalışmalarında, doğal β-kazein %23 β-yaprak, %15 β-dönüşü, %12 α-sarmal ve %50 rastgele sarmal yapılardan oluşurken, 4 saatlik proteolizden sonra triptik-hidrolize β-kazein (10:1 oranı) %23 β-yaprak, %18 β-dönüş, %16 α-sarmal ve %43 rastgele sarmal yapılardan oluşmakta olduğu belirlenmiştir. Böylece, α-helikslerdeki artışa eşlik eden rastgele sarmal yapısında bir azalma olur. FTIR sonuçlarına göre, 1645-1649 cm-1 bandı civarındaki intensite proteoliz sırasında hem 10:1 hem de 50:1 oranlarında artış göstermektedir. Bütün bunlar, α-heliks yapısındaki belirgin bir artışın ve rastgele sarmallardaki bir azalmanın, poliprolin II yapısından kaynaklanabileceğini veya alternatif olarak, sindirim nedeniyle sıkı bir şekilde paketlenmiş yapıların oluştuğunu göstermektedir. Özetlemek gerekirse, CD ve FTIR spektroskopileri, enzimatik sindirim sırasında gözlemlenen küçük ve önemli yapısal değişiklikleri tespit etmemize olanak sağlamıştır. Bu çalışma, bu tür substratların (BSA, β-laktoglobulin ve β-kazein), enzimatik saldırı sırasında agregasyon olmadan peptitlerin serbest fragmanlarına dönüştükten sonra ikincil yapılarını kaybettiğini ortaya koymaktadır. Bu bozulma, doğal proteinin omurgasını değiştirerek sağlam proteinin bozulmasına neden olur. Ayrıca, bir substratın proteoliz hızının, proteinlerin genel yapısal stabilitesi ve hidrofobikliğinin yanı sıra enzim spesifikliği ile de ilişkili olduğu sonucuna varılmıştır; çünkü proteinin hidrofobik bölgesinde gömülü olan peptit bağları, maskeleme etkisi nedeniyle enzimatik hidrolize karşı daha dirençlidir.
Özet (Çeviri)
Proteolysis induces degradation of food proteins in digestion and nutrition processes. Yet, the complexity of the enzyme specificity upon peptide bond is still far from being solved and it is not yet clear to figure out the liberated patterns of fragments and the secondary structure alterations of proteins during proteolysis. In the present work, the conformational changes of three proteins (BSA, β-lactoglobulin and β-casein), which are used as substrate, have been studied during proteolysis. For this purpose, trypsin and α-chymotrypsin were utilized as protease enzymes in various concentrations to digest the substrates. In this way, enzymatic-induced degradation of such proteins was identified. Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR) and Circular Dichroism Spectroscopy (CD) were performed to study the structural changes and to confirm the results of the enzymatic reactions. Temperature-profiling of BSA studied by FTIR spectroscopy revealed that the unfolding state progresses above 60 oC and then aggregation of the protein starts. The transition temperature between the folded and unfolded state was found 68.4 oC. Hence, this property does not affect the proteolysis process at our working temperature of 37 oC. Digestion of bovine serum albumin by trypsin and α-chymotrypsin at 37 oC in D2O buffer has been performed. In the FTIR studies, native BSA was found to have 68% α-helix, 20% β-sheet/extended, 12% β-turn in D2O solution whereas digested BSA by α-chymotrypsin at 10:1 ratio (harsher proteolysis condition) exhibited 32% α-helix, 17% β-sheet/extended, 18% β-turn and 33% random coil structure after 5h proteolysis, and the most significant spectral changes occur in the amide I and amide II regions for the all ratios of substrate and enzyme. In the CD studies, blank BSA consists of 65% α-helix, 4% β-sheet, 10% β-turn and 22% random coil while chymotryptic-digested BSA at 10:1 ratio shows 30% α-helix, 17% β-sheet/extended, 21% β-turn and 32% random coil structure after 5h hydrolysis. Estimation of changes in secondary structural elements by CD and FTIR studies clearly demonstrates that the content of the α-helices diminishes strongly whereas turns and unordered structures increase concomitant with a release of the free carboxylates (absorbing at ~1593 cm-1) due to the cleavage of the peptide bonds. It can be interpreted that the accessible α-helices are digested by enzyme and converted into the distorted or short helices (short fragments) and finally, the liberated free carboxylate groups appear as a proteolysis product. Thereby, both spectroscopies are in agreement to confirm the enzymatically-induced secondary structural changes. It is also concluded that the enzymatic breakdown of the secondary structural elements of BSA becomes more visible with an increasing amount of the enzyme, causing a more degraded BSA. Since trypsin predominantly cleaves the hydrophilic part of the intact protein (from the polar groups of lysine and arginine) and α-chymotrypsin adversely hydrolyses the substrate from the aromatic and large hydrophobic residues (tyrosine tryptophan, phenylalanine, methionine and leucine), degradation of BSA is less affected by trypsin than by α-chymotrypsin. Therefore, even a low concentration of α-chymotrypsin (E:S = 50:1 ratio) caused a strong decrease in the content of α-helix structure of BSA concomitant with an increment in turns and random coils. Temperature-profiling of β-lactoglobulin indicated that thermally induced changes of the 1678 cm-1 band occur in two stages, between 50-66 oC (phase 1) and above 66 oC (phase 2). Phase 1 exhibits monomerisation of the protein, suggesting a contact between two monomers of the protein. Phase 2 shows the unfolding state of β-Lg at higher temperatures. Temperature-profiling of 1632 cm-1 also reveals that the unfolding state starts above 66 oC. Hydrolysis of β-lactoglobulin by trypsin at 37 oC in D2O buffer was carried out using FTIR and CD spectroscopies. FTIR studies revealed that native β-Lg involves 53% β-sheet, 18% β-turn and 29% α-helix+random coil while digested β-Lg by trypsin at 10:1 ratio was found to have 24% β-sheet, 21% β-turn, 55% α-helix+random coil structure after 5h proteolysis. Furthermore, in the FTIR spectra of digested protein, the intensity of the 1593 cm-1 and 1406 cm-1 bands increases attributed to the antisymmetric and symmetric stretching of free carboxylates, respectively, as proteolysis products. According to the CD studies, native β-Lg consists of 42% β-sheet, 22% β-turn, 7% α-helix and 28% random coil structure whereas tryptic-digested β-Lg at the 10:1 ratio has 24% β-sheet, 16% β-turn, 5% α-helix and 54% random coil after 5h proteolysis. Thereby, the results of both spectroscopes clearly reveal that the content of β-sheet decreases marginally with a parallel increase in the unordered structures, causing breakdown of β-Lg into smaller fragments during digestion. Additionally, it was exhibited that the 10:1 and 50:1 ratios (S:E) degrade the β-Lg with a very close strength, but the 10:1 ratio induces more product than 50:1 ratio during digestion. This could be related to the accessibility of peptide bonds to the trypsin and to the structural stability of β-Lg. Temperature-profiling of β-casein performed by FTIR spectroscopy exhibited that some structural changes occur without unfolding upon raising the temperature but these continuous changes are reversible up to 90 oC. Moreover, the 1640 cm-1 band (random coil) shifts towards 1646 cm-1 up to 90 oC, suggesting movement of polyproline II structure from aqueous to a more hydrophobic environment. Digestion of β-casein by trypsin at 37 oC in D2O buffer was performed by FTIR and CD spectroscopies. According to the FTIR studies, native β-casein was found to have 20% β-sheet, 28% β-turn, 16% α-helix and 36% random coil whereas degraded β-casein by trypsin at 10:1 ratio involves 20% β-sheet, 27% β-turn, 14% α-helix and 39% random coil after 4h proteolysis. Remarkably, the α-helix content of the digested protein is only 8% at t = 5 min. In the CD studies, native β-casein comprises 23% β-sheet, 15% β-turn, 12% α-helix and 50% random coil structures while tryptic-hydrolysed β-casein (10:1 ratio) involves 23% β-sheet, 18% β-turn, 16% α-helix and 43% random coils after 4h proteolysis. Thereby, there is a decrease in random coil structure concomitant with an increase in α-helices. According to the FTIR results, the intensity around the 1645-1649 cm-1 band exhibits an increment for both 10:1 and 50:1 ratios during proteolysis. Altogether these suggest that an apparent increment in the α-helix structure and a diminution in random coils might be accounted for the polyproline II structure, or alternatively, tightly packed structures are formed due to digestion. To sum up, CD and FTIR spectroscopies have allowed us the detection of subtle and significant structural changes observed during enzymatic digestion. This study reveals that such substrates (BSA, β-lactoglobulin and β-casein) loose their secondary structures upon conversion to the free fragments of peptides without aggregation during enzymatic attack. This perturbation alters the backbone of the native protein resulting in degradation of the intact protein. It is also concluded that the rate of proteolysis of a substrate is related to the overall structural stability and hydrophobicity of proteins as well as enzyme specifty because peptide bonds buried in the hydrophobic region of protein are more resistant to enzymatic hydrolysis due to the masking effect.
Benzer Tezler
- Oksim grubu içeren yeni ligandlar ve metal komplekslerinin sentezi
Synthesis of oxime containing new ligands and metal complexes
SEDA ALKAN KABA
- Igy saflaştırılması ve biyogörüntüleme ajanı olarak değerlendirilmesi
Igy purification and evaluation as a bioimaging agent
RUKİYE DİDEM TOKLU
Yüksek Lisans
Türkçe
2020
BiyokimyaEskişehir Teknik Üniversitesiİleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ARZU ERSÖZ
- Manyetik katı faz ekstraksiyonu yöntemi ile kobalt ve kadmiyum iyonlarının önderiştirilmesi ve ICP-OES tayini
Preconcentration of with magnetic solid phase extraction and determination by ICP-OES
MELİKE YOĞURTÇUOĞLU ÇİFTÇİ
- 1,3,5 triazin-tetraetilen pentamin polimeri ile Cu(II) iyonlarının katı faz ekstraksiyonundan sonra çeşitli sebzelerde faas ile tayini
Determination of Cu(II) levels in various vegetables by faas after solid phase extraction using 1,3,5 triazine-tetraethylene pentamine polymer
HANDE NUR BEYZA ŞAĞBAN
- Bazı sülfonil hidrazin türevi metal komplekslerin titreşim spektrokopik incelemesi ve spekturum yapı ilişkisinin irdelenmesi
Vibrational spestroscopic studies of some metal complexes of sulfonyl hydrazine and discussing specturum-structure relation
MEHMET APAL