Polo-like Kinase 2 mediated regulation of the cell-and centrosome cycle in mammalian cells
Polo-benzeri Kinaz 2'nin memeli hücrelerinde hücre ve sentrozom döngüsünün düzenlenmesindeki görevi
- Tez No: 892081
- Danışmanlar: PROF. DR. INGRİD HOFFMANN
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2009
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Ruprecht-Karls-Universität-Heidelberg
- Enstitü: Yurtdışı Enstitü
- Ana Bilim Dalı: Biyolojik Bilimler Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 110
Özet
Sentrozomlar, kardeş kromatitlerin yavru hücrelere hassas bir şekilde ayrılmasına izin vermek için hücre döngüsü başına yalnızca bir kez kopyalanması gereken, zara bağlı olmayan organellerdir. Bu sıkı düzenleme, sentrozom döngüsünün, anahtar efektör moleküller aracılığıyla hücre döngüsüne bağlanmasıyla gerçekleştirilir. Polo benzeri kinaz 2 (Plk2), sentrozom duplikasyonunun düzenlenmesinde rol oynar, ancak kesin etki tarzını yöneten moleküler mekanizmalar belirsizdir. Bu çalışma, Plk2'nin hücre ve sentrozom duplikasyon döngüsündeki rollerini karakterize etmeyi amaçlamaktadır. İlk olarak, Plk2'nin sentrosom-altı lokalizasyonu, sentrozom ve sentriollerin çeşitli belirteçleri ile birlikte Plk2 antikorları kullanılarak araştırılmıştır. Sentrosomal Plk2'nin analizi, erken G1'de ana sentriol ile ilişkili olduğunu, ancak bunun sentriyollerle sınırlı olmadığını ve PCM'ye kadar uzandığını ortaya koymaktadır. Bununla birlikte, G1 / S geçişinde Plk2, anne ve yavru sentriyoller arasında düzgün bir şekilde lokalizedir. Polo-box alanları (PBD), Plk'ların en çok korunan yapısal özellikleridir. Bu çalışma, Plk2 PBD'nin sentrosomal lokalizasyonu ve fonksiyonu için kritik olan amino asitleri ortaya koymuştur. Ayrıca, Plk2'nin siRNA aracılı susturulmasının, sentriyollerin kısmi bir titrasyonuna ve mitozda monopolar iğlerin oluşumuna yol açması, Plk2'nin sentrozomların üremesi için önemli olabileceğini düşündürmektedir. Plk4'ün sentrozom duplikasyonunu düzenlemek için Cdk2 ile işbirliği yaptığı bulunmuştur. Plk2, Cdk2 veya Plk4 arasındaki varsayımsal çapraz ilişkileri bulmak için sentrozom yeniden duplikasyon testleri kullanılmıştır. Sonuçlar, Plk2 aracılı sentrozom duplikasyonunun sağlam bir Plk4 fonksiyonuna bağlı olduğunu ve Cdk2 ile Plk2'nin sentrozomların üremesini düzenlemede işbirliği yaptığını göstermiştir. Plk2 fonksiyonunun altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için, sentrozom döngüsünün seçilmiş anahtar düzenleyicilerinin protein seviyeleri, Plk2'nin siRNA aracılı susturulması üzerine analiz edildi. Verimli Plk2 susturulması, protein stabilitesinin azalmasının bir sonucu olarak siklin E seviyelerinde spesifik bir azalmaya yol açtı. Ek olarak, siklin E'nin poliubikitin aracılı bozunmasından sorumlu F-box proteini olan Fbxw7'nin Plk2 tükenmiş hücrelerde biriktiği bulundu. Plk2, in vitro kinaz deneylerinde Fbxw7'nin fosforilasyonunu verimli bir şekilde katalize etmiştir. Ayrıca, bu proteinlerin hem in vitro, hem de in vivo olarak etkileşime girdiği bulunmuştur. Fbxw7 üzerindeki ana Plk2 fosforilasyon bölgeleri (S25, S176 ve S349) kütle spektrometresi ile tanımlanmış ve in vitro kinaz deneylerinde doğrulanmıştır. Plk2'ye bağlı fosforilasyonun Fbxw7'nin stabilitesi üzerindeki etkisini araştırmak için, üç fosforilasyon bölgesi ya fosforile edilemeyen alanine (Fbxw7AAA) ya da fosfo taklit eden aspartik aside (Fbxw7DDD) mutasyona uğratıldı. Karşılık gelen mutantların protein stabilitesi, doğal fenotip proteininkiyle karşılaştırılmış ve Fbxw7DDD'nin önemli ölçüde dengesizleştiği ve Fbxw7AAA'nın ise doğal fenotip proteinden daha kararlı olduğunu ortaya çıkmıştır. İmmünofloresan çalışmaları, mitozda anafazın başlaması üzerine Plk2'nin iğ kutuplarından ayrıldığını ortaya koymıştır. Hücre altı lokalizasyon çalışmaları, Plk2'yi, orta gövdede tespit etmiştir. Ayrıca, Plk2'nin baskın negatif inhibisyonu veya siRNA aracılı yıkımı, anormal sitokinez ve çoklu çekirdeklenmeye yol açmış, bu da bozulmamış Plk2 kinaz aktivitesinin düzgün hücre bölünmesi için gerekli olabileceğini düşündürmüştür. Birlikte ele alındığında, bu tezde yapılan çalışmalar, Plk2'nin sentrozom duplikasyonunun temel bir düzenleyicisi olduğuna dair moleküler kanıtlar sağlamakta ve hücre bölünmesine olası katkıları olduğunu önermektedir.
Özet (Çeviri)
Centrosomes are non-membrane bound organelles that need to be replicated only once per cell cycle to allow faithful segregation of sister chromatids into the daughter cells. This tight regulation is accomplished by coupling of the centrosome cycle to the cell cycle through key effector molecules. Polo like kinase 2 (Plk2) was implicated in the regulation of the centrosome duplication but the molecular mechanisms governing its exact mode of action has been elusive. This study aimed to characterize the role of Plk2 in the cell and the centrosome duplication cycle. First, the sub-centrosomal localization of Plk2 was investigated using Plk2 antibodies together with various markers of the centrosome and centrioles. Analysis of centrosomal Plk2 revealed that in early G1 it associates with the mother centriole but this is not restricted to the centrioles and extends to the PCM. However, at the G1/S transition Plk2 is uniformly localized between the mother and the daughter centriole. Polo-box domains (PBD) are the most conserved structural features of the Plks. This study revealed the amino acids in Plk2 PBD that are critical for its centrosomal localization and function. Moreover siRNA mediated ablation of Plk2 led to a partial out-titration of centrioles and formation of monopolar spindles in mitosis, indicating that Plk2 might be important for the reproduction of centrosomes. Plk4 has been found to cooperate with Cdk2 to regulate centrosome duplication. Centrosome re-duplication assays were used to find out any putative cross-talk between Plk2 and Cdk2 or Plk4. The results indicated that Plk2 mediated centrosome duplication was dependent on an intact Plk4 function and Cdk2 and Plk2 cooperate in regulating reproduction of centrosomes. To dissect the molecular mechanisms underlying Plk2 function, protein levels of selected key regulators of centrosome cycle were analysed upon siRNA mediated down-regulation of Plk2. Efficient Plk2 knock-down led to a specific decrease in cyclin E levels, as a result of decreased protein stability. In addition, Fbxw7, the F-box protein responsible for polyubiquitin mediated degradation of cyclin E, was found to be accumulated in Plk2 depleted cells. Plk2 efficiently catalysed the phosphorylation of Fbxw7 in in vitro kinase assays. Moreover these proteins were found to be interacting both in vitro and in vivo. Major Plk2 phosphorylation sites on Fbxw7 (S25, S176 and S349) were identified via mass spectrometry and were confirmed in in vitro kinase assays. To investigate the effect of Plk2-dependent phosphorylation on the stability of Fbxw7, the three phosphorylation sites were mutated either to non-phosphorylatable alanine (Fbxw7AAA) or to phospho-mimicking aspartic acid (Fbxw7DDD). The protein stability of the corresponding mutants was compared to that of the wild type protein and revealed that Fbxw7DDD was remarkably destabilized whereas Fbxw7AAA was more stable than the wild type protein. Immunofluorescence studies revealed that Plk2 dissociates from the spindle poles upon initiation of anaphase in mitosis. Sub-cellular localization studies, in turn, detected Plk2 on the midbody. Moreover, either dominant negative inhibition or siRNA mediated knock-down of Plk2 lead to aberrant cytokinesis and multinucleation, suggesting that intact Plk2 kinase activity may be essential for proper cell division. Taken together, the studies carried out in the present work provide molecular evidence that Plk2 is an essential regulator of centrosome duplication and suggest its possible involvement in cell division.
Benzer Tezler
- Functional characterization of human polo-like kinase 2 in the cell cycle and identification of its putative in-vitro substrates
İnsan polo benzeri kinaz 2'nin hücre döngüsünde fonksiyonel karakterizasyonu ve varsayılan in vitro substratlarının tanımlanması
ONUR ÇİZMECİOĞLU
Yüksek Lisans
İngilizce
2004
BiyokimyaRuprecht-Karls-Universität-HeidelbergBiyolojik Bilimler Ana Bilim Dalı
PROF. DR. INGRİD HOFFMANN
- Coiled-coil domain containing 124 (CCDC-124) proteinine özgü monoklonal anti̇kor saflaştirilmasi, i̇mmün boyama ve bi̇yoki̇myasal metotlar i̇le anali̇zi̇
Coiled-coil domain containing 124 (CCDC-124) proteinine özgü monoklonal antikor saflaştırılması, immün boyama ve biyokimyasal metotlar i̇le analizi
ÇİĞDEM ÜLKÜSEVEN
Yüksek Lisans
Türkçe
2018
BiyokimyaGebze Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. UYGAR HALİS TAZEBAY
- Stress resistance analysis of yeast strains with mitotic exit-related gene deletions
Mitozdan çıkışla ilişkili genleri silinmiş maya hücrelerinin stres direnci analizi
RÜVEYDA GARGI
Yüksek Lisans
İngilizce
2023
Mikrobiyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
DR. ÖĞR. ÜYESİ AYŞE KOCA ÇAYDAŞI
- Kanser tedavisi için potansiyel polo-benzeri kinaz 1 (plk1) inhibitörlerinin hesaplamalı yaklaşımlar ile belirlenmesi ve plk1 protein hedefinin biyomoleküler etkileşimleri
Identification of potential polo-like kinase 1 (plk1) inhibitors for cancer therapy by computational approaches, and biomolecular interactions of polo-like kinase 1 (plk1) protein target
GÜLCE DAVUTLAR
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
BiyofizikÇanakkale Onsekiz Mart ÜniversitesiTıbbi Sistem Biyolojisi Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ FERAH CÖMERT ÖNDER
- The interaction between elk-1 and mitotic kinases in brain tumors
Beyin tümörlerinde elk-1 ve mitotik kinazlar arasi etkileşim
OYA ARI UYAR
Doktora
İngilizce
2019
BiyoteknolojiYeditepe ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. BAYRAM YILMAZ
PROF. DR. IŞIL KURNAZ