Detecting binding activity of a therapeutic monoclonal antibody targeting vascular endothelial growth factor using surface plasmon resonance
Vasküler endotelyal büyüme faktörünü hedeleyenterapötik monoklonal antikorun bağlanma aktivitesinin yüzey plazmon rezonans ile belirlenmesi
- Tez No: 895472
- Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ ABDULHALİM KILIÇ
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2024
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 87
Özet
Biyofarmasötiklerin ve bu grubun en büyük üyesi olan monoklonal antikorların (mAb'ler) kullanımı, rekombinant DNA teknolojisindeki ilerlemelerden sonra oldukça kritik bir uygulama haline gelmiştir. Kanser, astım, kardiyovasküler rahatsızlıklar, enfeksiyonlar ve alerjiler dâhil olmak üzere inflamatuar ve otoimmün bozukluklar gibi çeşitli hastalıkların tedavisi, monoklonal antikorların geliştirilmesiyle mümkün hale gelmeye başlamıştır. Monoklonal antikorların biyolojik olarak aktif olabilmeleri için glikolizasyon gibi post translasyonel modifikasyonlara ihtiyaç duyarlar. Bu modifikasyonların meydana gelebilmesi için üretimin gerçekleştireleceği konakçı hücrenin memeli hücresi olması gerekmektedir. Mikrobiyal konakçı hücrelerindeki protein katlama mekanizması birçok memeli proteinin ifadesi için yetersiz olduğundan monoklonal antikor üretimi karakterize edilmiş memeli hücre bankaları kullanılarak yapılır. Üretimin ilk adımı olan üst akım işlemi 12 ila 18 gün boyunca kontrollü hücre kültürü işlem parametreleri altındahedef gen ile transfekte edilmiş memeli hücre hattı kullanılarak gerçekleştirilir. Üst akım işleminin amacı, hücre canlılığını ve konsantrasyonunu yüksek tutarak maksimum kapasitede hedef monoklonal antikor üretimini gerçekleştirmektir. Hücre kültürü koşullarında meydana gelen ufakdeğişiklikler glikozilasyon ve safsızlık profilleri de dahil olmak üzere çeşitli kalite özelliklerine etki edebilir. Bu nedenle kültür koşulları dikkatlice kontrol edilmelidir. Hücrelerin çoğaltılması ve büyütülmesi için üretim veriminidoğrudan etkileyen oksijen, pH, sıcaklık ve karıştırma hızı gibi çevresel parametrelerin kontrollü olarak takip edilmesinisağlayan, biyofarmasötiklerin üretilmesindebiyoreaktörler kullanılır. Üst akım işleminden sonra, monoklonal antikorların önce hücre kültüründen hasat edilmesi ve ardından terapötik amaçlar için kullanılmadan önce saflaştırılması gerekir. Biyofarmasötik üretimde, ürünün hücre kültürü ortamından verimli bir şekilde eldesi ve saflaştırılması süreçteki kritik adımlardır. Saflaştırma sırasında uzaklaştırılması gereken safsızlıklar prosese bağlı safsızlıklar (örneğin, konak hücreden türetilen DNA ve proteinler) ve ürüne bağlı safsızlıklar (asidik-bazik varyantlar, parçalar, dimerler, agregatlar) olmak üzere ikiye ayrılır. Ayrıca, saflaştırma prosesi ürün güvenliliğini sağlamak için virüslerden de etkin bir şekilde uzaklaştırma yapabilme kapasitesine sahip olmalıdır. Saflaştırma prosesi, kimyasal fonsiyonlar kazandırılmış rezinler veya filtreler ile proteinlerin biyokimyasal ve / veya fiziksel özellikleri arasındaki etkileşimi kullanarak, istenmeyensafsızlıkları gidermek için temel olarak kolon kromatografisine ve filtrasyona dayanır. Hücre kültürüprosesinin geliştirilmesinde olduğu gibi, her bir operasyonel parametrenin (ör. pH, iletkenlik,bağlama kapasitesi veya akış hızı) ürünün kalitesini nasıl etkileyebileceğinikarakterizeetmek önemlidir. Krite kalite özelliklerinin belirlenmesi ile monoklonal antikorların karakterizasyonu ara veya bitmiş ürünün etkinliğini ve güvenliliğini belirlemek için oldukçaönemli bir adımdır. Rekombinant DNA teknolojisindeki ve antikor mühendisliğindeki gelişmeler ile farklı işlevsel özelliklere sahip çeşitli antikor üretimleri gerçekleştirilebilmeye başlanmıştır. Monoklonal antikorların yapılarının karmaşık olması ve canlı bir sistem tarafından ifade edildiği için ve üretimden üretime değişkenlik gösterebildiği için kapsamlı karakterizasyon çalışmalarının yapılması gerekmektedir. Terapötik monoklonal antikorlarının karakterizasyonu konvansiyonel ve küçük moleküllü ilaçlara kıyasla oldukça zordur. Ürünün yapısal ve işlevsel özelliklerinin belirlenmesi ve düzenleyici yönergelerle uyumlu olarak proses-ürünle ilgili safsızlıkların tespit edilmesi gerekir. Monoklonal antikorların karakterizasyonu temel olarak iki başlık altında incelenebilir. İlki, protein yapıda olan monoklonal antikorların birincil, ikincil ve yüksek yapılarını belirlemek için yapısal karakterizasyonlar; ikincisi ise üretilen monoklonal anikorun biyolojik aktivitesini göstermeyi hedefleyen fonksiyonel karakterizasyondur. Monoklonal antikorların birincil yapı analizlerinde amino asit dizilerinin tanımlanması hedeflenir ve kütle spektroskopisi ve ters faz HPLC yöntemleri yaygın olarak kullanılır. Monoklonal antikorların ikincil, üçüncül ve dördüncül yapıları proteinin fonksiyonel aktivitesini belirleyen yüksek dereceli yapılardır ve molekülün üç boyutlu yapısından ve uygun katlanmasından sorumludur. İkincil yapı karakterizasyonunda α-heliks ve β-yaprak yüzdelerini belirlemek için dairesel dikroizm ve fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi (FT-IR) yaygın olarak kullanılır. Monoklonal antikorların üç-boyutlu yapısını belirlemek için çeşitli kütle spektroskopisi yaklaşımları uygulanır. Biyolojik olarak aktif bir ürün eldesi monoklonal antikor üretim sürecinin en kritik noktalarından biridir. Bu nedenle fonksiyonel karakterizasyon yöntemleri uygulayarak üretilen ürünün biyolojik aktivetisinin belirlenmesi gerekir. Üretilen monoklonal antikorun hedef antijeni ile etkileşimi birincil kalite özelliğidir. Enzime bağlı immünosorbent analizleri (ELISA) ve yüzey plazmon rezonansı (SPR) teknolojisi antikor antijen etkileşimini belirlemek için kullanılan temel yöntemlerdir. ELISA ve SPR yöntemleri, bağlanma aktivitesini belirlemek için tamamlayıcı teknikler olarak kabul edilirken, SPR teknolojisi bağlanma kinetiğini kantitatif olarak ölçebilir. Monoklonal antikorların farmakokinetiği ve biyolojik aktiviteleri, hedef antijene bağlanmalarına dayanır ve monklonal antikorların karakterizasyonu için oldukça önemlidir. Monoklonal antikorların etki mekanizmasını anlamak için hücre-tabanlı analizler çok önemlidir. Monoklonal antikorlar, canlı bir sistemde hedef antijene bağlandıktan sonra aşağı doğru sinyal iletimine sebep olan geç yanıt etki mekanizmasına sahip olabilir. Bu nedenle, biyolojik aktiviteyi yalnızca SPR ve ELISA gibi ligand bağlama analizleri ile belirlemek yeterli olmayabilir. Hücre-tabanlı analizler geç yanıt mekanizmasını belirlemek için en etkili yöntemdir. Yüzey plazmon rezonans (SPR) teknolojisi, etiketleme işlemi yapılmasına gerek olmadan biyomoleküler etkileşimleri gerçek zamanlı olarak tespit edebilen, yaygın ve güvenilir bir yöntemdir. Bir mAb molekülünün hedef reseptörü ile olan etkileşimi sonucu ortaya çıkan kinetik değerlerin belirlenmesi ve bitmiş ürünün bağlanma aktivitesini karakterize etmek için SPR yönteminin kullanılması etkili bir yaklaşımdır. İki molekül arasındaki bağlanma kinetiğini karakterize etmek için öncelikle moleküllerden biri (ligand), immobilizasyon veya yakalama teknikleri uygulanarak sensör çipi yüzeyinde stabilize edilir. Ardından, diğer molekül (analit), hareketli bir mobil faz içerisinde farklı konsantrasyonlarda sensör çipi yüzeyinden geçirilir. Analit molekülü, kompleks bir yapı oluşturmak için sensör yüzeyine bağlı ligand molekülüyle etkileşime girebilirse, sensör yüzeyindeki yerel kırılma indisi değişir ve bu da SPR açısında bir değişikliğe neden olur. Etkileşim gerçek zamanlı olarak izlenebildiğinden, ligand-analit kompleks oluşumunun ilişki hızı sabiti, yansıyan ışığın yoğunluğundaki değişikliklere göre hesaplanabilir. Etkileşen ve ayrışan analit miktarı birbirine eşit olduğunda, analitin konsantrasyonuna bağlı olan etkileşimden elde edilen yanıt seviyesi bir platoya ulaşır. Bağlanma aşamasını, kompleks formun ayrışma süresini/hızını belirlemek için analit molekül içermeyen bir yıkama tamponu ile sensör yüzeyinin yıkanması takip eder. Bu adım ayrışma adımı olarak nitelendirilir. Son adımda, sensör çipinin yüzeyi kalan tüm kompleksleri uzaklaştırmak için bir rejenerasyon solüsyonuyla yıkanır. Tüm yanıtlar rezonans birimlerinde ölçülür ve elde edilen yanıtlar zamana karşı çizilen bir sensörgramda gösterilir. Bu çalışmada, Protein A çip yüzeyine ilgili IgG monoklonal antikor yakalandıktan sonra hedef VEGF121 büyüme faktörü, 5 farklı konsantrasyonda yüzey üzerinden geçirilmiştir. Tek döngülü kinetik analiz kullanılarak kinetik parametreler belirlenmiş ve iki molekül arasındaki etkileşim incelenmiştir. Sağlam bir kinetik analiz geliştirmek için, yakalama molekülü (mAb) konsantrasyonu, VEGF121 molekülünün konsantrasyon aralığı, ayrışma süresi, rejenerasyon süresi ve yöntem sekansı dahil olmak üzere çeşitli parametrelerin optimize edilmesi gerekmiştir. Yöntemin sağlamlığını ve güvenilirliğini değerlendirirken, değerlendirme yazılımından alınan kalite kontrol parametreleri, kalıntı grafikleri, tekrarlar arasındaki Rmax ve KD değerlerinin tutarlılığı gibi önemli faktörler dikkate alınmıştır. Yöntem geliştirme çalışmaları sonucunda tekrarlı çalışmalar arasındaki KD değerlerindeki sapmanın % 20'den az olmasını sağlayan 13.4nM yakalama konsantrasyonuna, 240 saniye ayrışma süresine ve 30 saniye rejenerasyon süresine karar verilmiştir. Tekrarlı çalışmalar arasındaki KD değeri düşük sapma ile elde edildikten sonra özgüllük, sistem kesinliği, tekrarlanabilirlik ve yöntem kesinlik parametrelerini içeren kalifikasyon çalışmalarına başlanmıştır. Sonuç olarak iki ayrı analist tarafından 6 tekrarlı yapılan çalışmalar sonucunda analistler arasındaki % fark 0.14 % olarak belirlenmiştir. Ayrıca, geliştirilen yöntemin farklı lotlardaki mAb molekülünün bağlanma aktivitesini belirlemede ne kadar etkili olacağını göstermek için 12 farklı üretim serisine sahip mAb molekülleri ile kinetik bağlanma çalışmaları yapılmıştır. Bu çalışmalar farklı üretim serilerine sahip mAb moleküllerindenbirbirine oldukça benzer kinetik parametreler elde edilmiştir.
Özet (Çeviri)
The use of biopharmaceuticals, particularly monoclonal antibodies (mAbs), has become a major application following advancements in recombinant DNA technology. The treatment of a wide range of diseases, among them cancer, asthma, cardiovascular conditions, infections, inflammatory and autoimmune disorders, including allergies, has become possible with the development of mAbs. Surface plasmon resonance (SPR) is a well-known and reliable method that can evaluate biomolecular interactions in real-time in terms of binding affinity and kinetics without requiring labeling procedures. Using SPR technology to determine the kinetic parameters of a mAb molecule resulting from its binding with its target receptor is a common approach to characterize the binding activity of the final product. To characterize the binding kinetics between two molecules, one molecule is first stabilized on the sensor chip surface by immobilization or capturing steps. Then, the other molecule is flowed over the sensor chip surface at variety concentrations in a running buffer to observe the interaction between the two molecules and to determine the resulting kinetic parameters. In this study, after an IgG monoclonal antibody was captured on a Protein A chip surface, the target VEGF121 growth factor was flowed over the surface at five different concentrations. By employing single-cycle kinetic analysis, the kinetic parameters were measured, providing information about the interaction between the two molecules. To develop a robust kinetic assay, it was necessary to optimize several parameters, including the capture molecule (mAb) concentration, the concentration range of the VEGF121 molecule, dissociation time, regeneration time, and the established method sequence. While evaluating the robustness and reliability of the method, important factors considered included quality control parameters from the evaluation software, plotted residuals, and the consistency of Rmax and KD values between replicates. As a result of the method development studies, a capture concentration of 13.4 nM, a dissociation time of 240 seconds and a regeneration time of 30 seconds were decided upon, ensuring that the deviation in KD values between repeated studies was less than 20 %. After the KD value was obtained with low deviation between replicate studies, qualification studies including specificity, system precision, repeatability and intermediate precision parameters were initiated. As a result of 6 replicate studies conducted by two different analysts, the percentage difference between the analysts was determined to be 0.14%. Additionally, kinetic binding studies were performed with mAb molecules from 12 different production batches to demonstrate the effectiveness of the developed method in determining the binding activity of mAb molecules in different lots. These studies showed quite similar kinetic parameters for different production batches.
Benzer Tezler
- WRN helikaz aktivitesinin tespiti ve WRN proteininin hedefli yıkımı ile potansiyel anti-kanser etkisinin araştırılması
Detection of WRN helicase activity and investigation of potential anti-cancer effects of targeted WRN protein degradation
ALİYE BEYZA ÖZÇELİK
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
Moleküler TıpNecmettin Erbakan ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. SÜNDÜS ERBAŞ ÇAKMAK
- Production of recombinant antibody fragments in bacteria and their development towards medical diagnosis
Rekombinant antikor fragmanlarının bakterilerde üretimi ve tıbbi tanıya yönelik geliştirilmesi
İLKAY KOÇER KULOĞLU
Doktora
İngilizce
2021
Kimya MühendisliğiHacettepe ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. EDA ÇELİK AKDUR
PROF. DR. MATTHEW P. DELISA
- PD-L1 proteinine yönelik görüntüleme ajanı geliştirilmesi ve sentezi
Development and synthesis of moleculer imaging agent for protein PD-L1
CEYDA KÖSE
Yüksek Lisans
Türkçe
2020
Kimyaİstanbul Teknik ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ ONUR ALPTÜRK
DR. ÖZGÜR YILMAZ
- Nükleosit analoğu bazı sitotoksik antineoplastik ilaçların dsDNA ile etkileşim mekanizmaları ve elektrokimyasal analizleri
Interaction mechanisms with dsDNA and electrochemical analysis of some nucleoside analogue cytotoxic antineoplastic drugs
PELİN ŞENEL
- Kitosan/ZnFe2O4 nanokompozit malzemesi hazırlanması, karakterizasyonu ve kanser ilacı yüklenen malzemeden ilaç salımının incelenmesi
Preparation, characterization and examination of drug release from cancer drug loaded nanocomposite chitosan/ZnFe2O4 material
MERVE ECE TEMELKURAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2023
Biyokimyaİstanbul Teknik ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. FATMA BEDİA BERKER
ÖĞR. GÖR. ZEYNEP KALAYCIOĞLU