Geri Dön

Pseudomonas aeruginosa bakteriyofaj kokteyli hazırlanması ve fare yanık yara enfeksiyon modelinde tedavideki etkinliğinin değerlendirilmesi

Preparation of pseudomonas aeruginosa bacteriophage cocktail and evaluation of therapeutic efficacy in mouse burn wound infection model

  1. Tez No: 903254
  2. Yazar: ILGIN ATA VURAL
  3. Danışmanlar: DOÇ. DR. AYLİN ÜSKÜDAR GÜÇLÜ
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Mikrobiyoloji, Microbiology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2024
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Başkent Üniversitesi
  10. Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Tıbbi Mikrobiyoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 95

Özet

Pseudomonas aeruginosa, birçok hastane enfeksiyonundan sorumlu kateterize veya yanık hastalarında ciddi, akut ve kronik enfeksiyonlara neden olan fırsatçı bir patojendir. P.aeruginosa'da patogeneze katkıları bulunan çeşitli virülans faktörleri tanımlanmıştır. P.aeruginosa günümüzde özellikle permeabilitedeki azalma, mutasyonlar, enzimatik inaktivasyon veya dış atım pompaları gibi mekanizmalarla çok sayıda antimikrobiyal ajana dirençli duruma gelmiş ve tedavideki güçlükler nedeniyle yeni teröpatik ajanlara ihtiyaç duyulmaktadır. Bakteriyofajlar (faj) da, çok ilaca dirençli bakteriyel enfeksiyonların tedavisi için potansiyel bir terapötik adaydır. Bu çalışmada atık su, nehir ve göl gibi çeşitli su kaynaklarından, P.aeruginosa izolatlarına etkili faj izole etmek ve bu fajların klinik izolatlardaki etkinlik spektrumunu araştırmak, fajları karakterize etmek ve in vivo olarak da etkinliğini test etmek amaçlanmıştır. Faj izolasyonu için çeşitli su kaynaklarından periyodik olarak su örneği alınmıştır. İzole edilen fajlar zenginleştirilip saflaştırılmış ve etki spektrumları P.aeruginosa klinik izolatlarında araştırılmıştır. İn vivo çalışmalar için PAO1 suşuna en etkili litik aktiviteye sahip olan fajlar seçilmiştir. Fajların morfolojik yapılarının incelenmesi için transmisyon elektron mikroskop (TEM) görüntüsü alınmıştır. İzole edilen fajların konak aralığı analizi, farklı bakteri türleri üzerinde spot test ile belirlenmiştir. Etkin bulunan fajların tam genom analizleri yapılarak genomlarında virülans faktörlerini ve antibiyotik direnç kodlayan genleri taşımayan fajlar in vivo çalışmaya dahil edilmiştir. İn vitro testleri tamamlanan fajların 3 tanesiyle bir faj kokteyli oluşturulmuş ve in vivo etkinliği test edilmiştir. Bu amaçla fareler üzerinde total vücut yüzey alanının %10'unu kapsayacak şekilde yanık yarası oluşturulmuş, takiben ̴1.05x107 konsantrasyonunda hazırlanan P. aeruginosa PAO1 solüsyonundan 100 µl kullanılarak yanık yarasında subkutan yolla enfeksiyon oluşturulmuştur. Toplam 45 Balb/c türü fare 5 gruba ayrılmıştır(0.80 güç ve %95 güven düzeyinde tek yönlü varyans analizi G-Power ile belirlenmiştir). 1. Grup; yanık yarası oluşturulan ve enfeksiyon oluşturulmayan kontrol grubu (YK). 2. Grup; yanık yarası ve enfeksiyon oluşturulan tedavi almayan kontrol grubu (SHAM); 3. Grup; yanık yarası oluşturulan ve enfeksiyon oluşturulmayan, faj kokteyli uygulanan toksisite kontrol grubu (YF); 4.Grup yanık yarası ve enfeksiyon oluşturulan, faj kokteyli tedavisi alan (YEF); 5. grup; yanık yarası ve enfeksiyon oluşturulan, antibiyotik (sefepim) tedavisi alan grup (YEA). Enfeksiyona ait parametrelerin takibi için tüm gruplarda 3 ve 7. günlerde kalp kanı alınarak CRP bakılmıştır. Ayrıca, 3. ve 7.günlerde her gruptan sırasıyla 4 ve 5 adet hayvan olmak üzere sakrifiye edilerek kan ve doku örneği alınmıştır. Doku örneklerinde hem kantitatif kültür yöntemiyle bakteri yükü hesaplanmış hem de histopatolojik inceleme yapılarak enflamatuar süreç incelenmiştir. Ayrıca her gün doku iyileşmesinin takibi için yara yüzeyi ölçülerek % yara kapanma oranı hesaplanmış ve dijital fotoğraf makinesi ile kaydedilmiştir. Deney sonunda sağ kalım yüzdeleri de hesaplanarak grup içinde ve gruplar arasında karşılaştırılmıştır. Çalışmada incelenen 5 gruba ait tanımlayıcı istatistikler ve dağılım değerleri değerlendirildikten sonra histopatoloji, CRP ve bakteriyel yük grup SHAM, grup YEF ve grup YEA grupları arasında nonparametrik testler ile değerlendirilmiştir. Histopatolojik bulguların değerlendirilmesinde kruskal wallis testi, CRP ve bakteriyel yüklerin değerlendirilmesinde ise friedman testinden faydalanılmıştır. Çalışmamızda PAO1 suşuna etkili 3 adet litik faj izole edilmiştir. Bu fajların Tam genom dizilerinin sonuçlarına göre yapılan biyoinformatik analizlerle yeni fajlar oldukları belirlenmiştir. Fajlar isimlendirildikten sonra GenBank'a yüklenmiştir. Faj kokteylinin in vivo etkinliği değerlendirilmiştir. Histopatolojik incelemelerde SHAM, YEF ve YEA grupları arasında istatiksel olarak herhangi bir farklılık tespit edilememiştir (p=0,2687; KW=2,808). CRP bakımından SHAM, YEF ve YEA grupları arasında istatiksel olarak herhangi bir farklılık tespit edilememiştir (p=0,5000; X_r^2= 3,00). Tüm gruplar bakımından 3. ve 7. günlerde CRP değerleri kıyaslandığında ise gruplar arasında istatiksel olarak bir farklılık elde edilmiştir (p=0,0417; X_r^2 = 7,600). Gruplar arasındaki farklılık özellikle YK ve SHAM grupları arasında gözlenmiştir. SHAM, YEF ve YEA grupları arasında 3. ve 7. gün bakteri yükü bakımından farlılık elde edilmiştir (p=0,0093; X_r^2 = 7,60). Özellikle SHAM ve YEF grupları arasındaki farklılık önemli bulunmuştur(p=0,0354). Çalışmamızda elde ettiğimiz faj kokteyli, antibiyotik tedavisine bir alternatif olabileceğinden klinik çalışmalara öncü niteliği taşımaktadır.

Özet (Çeviri)

Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen responsible for serious, acute, and chronic infections in catheterized or burn patients, contributing to numerous hospital-acquired infections. Various virulence factors have been identified that contribute to the pathogenesis of P. aeruginosa. Nowadays, P. aeruginosa has become resistant to many antimicrobial agents through mechanisms such as decreased permeability, mutations, enzymatic inactivation, or efflux pumps, necessitating new therapeutic agents due to treatment difficulties. Bacteriophages (phages) are potential therapeutic candidates for the treatment of multidrug-resistant bacterial infections. This study aims to isolate phages effective against P. aeruginosa isolates from various water sources such as wastewater, rivers, and lakes, investigate their efficacy spectrum on clinical isolates, characterize the phages, and test their in vivo efficacy. Water samples were periodically collected from various water sources for phage isolation. The isolated phages were enriched, purified, and their efficacy spectrum was investigated on P. aeruginosa clinical isolates. Phages with the most effective lytic activity against the PAO1 strain were selected for in vivo studies. Transmission electron microscopy (TEM) was used to examine the morphological structures of the phages. The host range analysis of the isolated phages was determined using spot tests on different bacterial species. Phages that did not carry virulence factors or antibiotic resistance genes in their genomes, as determined by complete genome analysis, were included in the in vivo study. A phage cocktail was prepared with three phages that completed in vitro tests and its in vivo efficacy was tested. For this purpose, burn wounds covering 10% of the total body surface area were created on mice, followed by subcutaneous infection of the burn wound with 100 µl of P. aeruginosa PAO1 solution prepared at a concentration of ̴1.05x10⁷. A total of 45 Balb/c mice were divided into 5 groups (determined by one-way analysis of variance with 0.80 power and 95% confidence level using G-Power). Group 1: control group with burn wound and no infection (YK). Group 2: control group with burn wound and infection but no treatment (SHAM). Group 3: toxicity control group with burn wound, no infection, and phage cocktail application (YF). Group 4: treatment group with burn wound, infection, and phage cocktail therapy (YEF). Group 5: treatment group with burn wound, infection, and antibiotic (cefepime) therapy (YEA). To monitor infection parameters, CRP was measured from heart blood samples taken on days 3 and 7 in all groups. Additionally, on days 3 and 7, 4 and 5 animals from each group were sacrificed respectively, and blood and tissue samples were taken. The bacterial load in tissue samples was calculated using quantitative culture methods and the inflammatory process was examined histopathologically. Furthermore, wound surface area was measured daily to calculate the percentage of wound closure and recorded with a digital camera. Survival rates were calculated at the end of the experiment and compared within and between groups. After evaluating the descriptive statistics and distribution values of the five groups examined in the study, histopathology, CRP, and bacterial load were assessed between the SHAM, YEF, and YEA groups using non-parametric tests. The Kruskal-Wallis test was used for the evaluation of histopathological findings, while the Friedman test was employed for the assessment of CRP and bacterial loads. In our study, three lytic phages effective against the PAO1 strain were isolated. Bioinformatic analyses based on the complete genome sequences of these phages revealed that they are novel. After being named, the phages were uploaded to GenBank. The in vivo efficacy of the phage cocktail was evaluated. Histopathological examinations showed no statistical differences between the SHAM, YEF, and YEA groups (p=0.2687; KW=2.808). Regarding CRP levels, no statistical differences were found between the SHAM, YEF, and YEA groups (p=0.5000; X_r^2= 3.00). However, when comparing the CRP values on days 3 and 7 across all groups, a significant difference was observed (p=0.0417; X_r^2 = 7.600). This difference was particularly noted between the YK and SHAM groups. A difference in bacterial load was also observed between the SHAM, YEF, and YEA groups on days 3 and 7 (p=0.0093; X_r^2 = 7.60), with a significant difference especially noted between the SHAM and YEF groups (p=0.0354). The phage cocktail obtained in our study holds potential as an alternative to antibiotic treatment, thus serving as a precursor to clinical studies.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    424746

    Antibiyotik dirençli Pseudomonas aeruginosa suşlarına spesifik litik bakteriyofaj izolasyonu ve izole edilen bakteriyofajların litik spektrumlarının belirlenmesi

    Isolation of lytic bacteriophages against multidrug resistant Pseudomonas aeruginosa isolates and determine their lytic spectrums

    ERGÜN AKTÜRK

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2015

    Klinik Bakteriyoloji ve Enfeksiyon HastalıklarıŞifa Üniversitesi

    Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. HALİL İBRAHİM ATABAY

    PROF. DR. SİNEM AKÇALI

  2. Tez No

    899128

    Antibiyotiğe dirençli pseudomonas aeruginosa'larda lizojenik ve litik bakteriyofaj varlığı ve PIP/TAZ antibiyotik ile sinerji etkinliğinin araştırılması

    Detection of the lysogenic and lytic bacteriophage of antibiotic resistant pseudomonas aeruginosa and synergistic effect with PIP/TAZ antibiotic

    NAWAL MAHMOOD ALI AL AAZI

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    MikrobiyolojiGaziantep Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. İBRAHİM HALİL KILIÇ

    PROF. DR. YASEMİN ZER

  3. Tez No

    698466

    Pseudomonas aeruginosa'yı inhibe eden bakteriyofajların izole ve karakterize edilmesi ve tavuk etinde biyokoruyucu olarak kullanılma potansiyellerinin belirlenmesi

    Isolation and characterization of bacteriophages inhibiting pseudomonas aeruginosa and determining their potential of utilization as bioprotective in chicken meat

    NAZİFE YILMAZ

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2021

    BiyoteknolojiNiğde Ömer Halisdemir Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZELİHA YILDIRIM

  4. Tez No

    879420

    Çoklu ilaç dirençli Pseudomonas aeruginosa izolatlarına karşı litik bakteriyofajın izolasyonu, karakterizasyonu ve fajın n-asetil sistein ile biyofilm üzerindeki etkisi

    Isolation and characterization of a lytic bacteriophage against multidrug resistant Pseudomonas aeruginosa isolates and its effect on n-acetyl cysteine and biofilm

    MAJDA LICINA

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    BiyoteknolojiAkdeniz Üniversitesi

    Tıbbi Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AHMET YILMAZ ÇOBAN

  5. Tez No

    394268

    S-pyocins as potential antimicrobial agents for eradicating pseudomonas aeruginosa biofilms

    Pseudomonas aeruginosa biyofilmlerini yok etmek i̇çin potansiyel antimikrobiyal ajanlar olarak s-pyosinler

    ENES KARABOĞA

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2014

    BiyoteknolojiSabancı Üniversitesi

    Biyoloji Bilimleri ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. ERDAL TOPRAK

Geri Dön