Bağırsak hasar modellerinde kemik iliği mezenkimal kök hücre ve bağırsak mezenkimal kök hücrelerin rejeneratif ve immün modülatuvar etkilerinin karşılaştırılması
Comparison of regenerative and immune modulatory effecets of bone marrow and intestinal mesenchymal stem cells i intestinal damage models
- Tez No: 919272
- Danışmanlar: DOÇ. DR. FATİMA AERTS KAYA
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Hacettepe Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Kök Hücre Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 151
Özet
. Allojenik hematopoetik kök hücre nakli (allo-HKHN), birçok malign veya malign olmayan hematolojik hastalıklar için tek tedavi seçeneğidir. Greft versus host hastalığı (GvHD), allo-HKHN'den sonra donör kaynaklı T hücrelerinin alıcı hücrelerin yüzeyindeki Majör Doku Uyumluluk Kompleksi (MHC) proteinlerine genel tepkisiyle ortaya çıkabilmektedir. Akut GvHD (aGvHD)'nin mevcut klinik öncesi çalışmaları, farelerde önemli rahatsızlıklara ve ölüme yol açabilmektedir. Bu nedenle, bu tez kapsamında, daha az zarara neden olan ve temsili bir hastalık modeli olarak işlev gören alternatif intestinal aGvHD fare modelinin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bağırsak hasarı mevcut skorlama sistemininin uygunluğu test etmek amacıyla ilk olarak immün yetmezliği olan Balb/c-Rag2-/- (Rag2) farelerinde DSS ile İnflamatuvar Bağırsak Hastalığı (İBH) modeli indüklenmiştir. İntestinal aGvHD in vivo ve in vitro modelleri geliştirmek için aktive edilmiş MHC-uyumsuz T hücreler, Rag2 farelerine düşük doz busulfan sonrası infüze edilmiş, Rag2 kolonoidlerile ko-kültür edilmiştir. İntestinal aGvHD indüklendikten sonra kemik iliği ve intestinal mezenkimal stromal/kök hücrelerinin aGvHD şiddeti üzerindeki etkileri, göçü, immün modülatuvar ve rejeneratif potansiyeli değerlendirilmiştir. Geliştirdiğimiz Rag2 intestinal aGvHD modelinde intestinal hasar histolojik açıdan belirgin, ancak bağırsak dışı doku tutulumu az olduğu görülmüştür. Bu nedenle deney sırasında mevcut modellere göre hayvan kaybı görülmemiştir. Ayrıca, in vitro aGvHDin-a-dish modelimizin in vivo modelimize büyük benzerlik göstermesi bu modelin intestinal aGvHD'yi modellemek için uygun ve daha pratik olduğu düşünülmektedir. Birçok malign veya malign olmayan hematolojik hastalıklar için tek küratif tedavi seçeneği allojenik HKH nakli (allo-HKHN)'dir. Allo-HKHN öncesinde hastalara uygulanan radyoterapi veya kemoterapi (hazırlık rejimi) sonrasında özellikle deri ve bağırsaklar gibi hızlı bölünen dokularda ağır hasar meydana gelebilmektedir. Sistemik inflamatuvar hastalık olarak tanımlanan GvHD, allo-HKHN sonrasında donör T hücrelerinin (greft), alıcı (host) hücrelerin yüzeyinde bulunan insan lökosit antijen (Human Leukocyte Antigen, HLA) proteinlerine karşı cevabı ile oluşmaktadır. GvHD'nin süreci akut (a) ve kronik (k) olmak üzere iki ana gruba ayrılmaktadır. aGvHD semptomları genellikle allo-HKHN naklinden sonra ilk 100 gün içerisinde gelişebilmektedir ve aGvHD'ye bağlı olan mortalite oranları %15'e kadar çıkabilmektedir. Crohn Hastalığı (CH) ve Ülseratif Kolit (ÜK)'ten oluşan İBH'de yaygın bağırsak enflamasyonu görülmektedir. Prevalansı yüksek olan İBH'nin nedenleri multifaktöryeldir; genetik yatkınlık, çevresel faktörler ve mukozal immün toleransta bozulma sonucu oluşan aşırı immün yanıt nedenler arasındadır. Crohn transmural enflamasyona, bağırsak granülomlarına, darlıklarına ve internal fistüllere neden olup gastrointestinal sistemin herhangi bir yerini (genelikle terminal ileum) etkilerken, ÜK ise mukozal enflamasyonla karakterize edilir ve etki bölgesi kolonla sınırlıdır. Crohn hastalığı ilerledikçe bağırsak katmanları kalınlaşmaktadır ve karın ağrısı, ishal, enflamasyon ve ateş semptomları görülmektedir. Göz, eklem, kan, karaciğer, böbrek ve pankreas tutulması hastalığın bağırsak dışındaki belirtileridir. ÜK'te başlıca klinik bulgular ishal, rektal ağrı, kasılma tarzında karın ağrısı, ateş ve kilo kaybı ile hastalığın ilerlemesiyle birlikte görülen kanlı ishallerdir. Ayrıca bu hastalarda, hastalığın şiddetine bağlı olarak kolon perforasyonları, akut kolon dilatasyonu, kolon kanseri ve kolon dışında deri lezyonu, göz hastalıkları, karaciğer yetmezliği, kemik ve eklem hastalıkları da oluşabilmektedir. İBH tedavisinde mevcut yaklaşımların arasında, farmakolojik ajanlar ile aşırı immün yanıtın baskılaması ve/veya ileri evre iltihaplanmış bağırsak dokusunun ameliyatla alınması bulunmaktadır. ÜK tedavisi için antidiyaretikler, antispazmodikler ve analjezikler kullanılmaktadır. Hastalığın şiddetine bağlı olarak kortikosteroidler ve immünomodulatuvar ilaçlar (siklosporin, rapamisin, fusidik asit vs) önerilmektedir. Ayrıca IFN-α, anti-TNF antikorları, rekombinant anti-inflamatuvar sitokinler, IL-1, IL-12, IL-16 ve IL-18 reseptör agonistleri, G-CSF ve probiyotikler hastalığın tedavisinde kullanılmaktadır. Crohn hastalığında da mevcut tedaviler remisyonun sağlanması, enflamasyonun azaltılması ve beslenme durumunun düzenlenmesini hedeflemekte ve anti-enflamatuvar ile immünomodülatuvar ilaçlar kullanılmaktadır. Ancak bu hastalıklarda kullanılan ilaçlar/tedavi yöntemleri, küratif tedavi sunmamakla birlikte birçok yan etki göstermektedir. Bu nedenle, İBH'de yeni alternatif tedavilerin geliştirilmesine gereksinim duyulmaktadır. Multipotent mezenkimal kök/stromal hücreler (MKH)'ler; başta kemik iliği olmak üzere, adipoz doku, göbek kordonu ve plasenta gibi birden çok stromal dokudan elde edilebilmektedir. MKH'ler; osteojenik, adipojenik ve kondrojenik yöne farklılaşma yapmakta ve hücre yüzeyinde yüksek seviyede CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 ve CD166 antijenlerini ifade etmektedir. MKH'lerin kendini yenilemesi, hasarlı dokuya göç edebilmesi, immünomodülatuvar özellikleri ve rejeneratif potansiyelinden dolayı klinik çalışmalarda ve hücresel/gen tedavi araştırmalarında kullanılmaktadır. İmmünomodülatuvar ve rejeneratif özelliklere sahip MKH'ler, aGvHD, multipl skleroz, otoimmün romatoid artrit gibi çeşitli otoimmün ve alloimmün hastalıkların tedavisi için klinik olarak test edilmiştir. MKH'ler, yüzeylerinde ifade ettikleri kemokin reseptörü CXCR4 ile Kİ ve hasarlı dokudan salınan CXCL12 (SDF-1) gradiyentine doğru göç etmektedir ve CXCR4/CXCL12 etkileşimi MKH'lerin hasarlı dokuya göçünde (yerleşmesinde) ve hominginde (yuvaya dönmesi ve tutulmasında) ana rol oynamaktadır. MKH'ler göçte daha az etkili olan diğer kemokin reseptörlerini de (CCR1, CCR4, CCR7, CCR9, CCR10, CXCR5 ve CXCR6) değişken seviyelerde ifade etmektedir. Daha önce yayımlanan bir çalışmamızda altın standart olarak kabul edilen tripsin enzimatik yöntemi ile toplanan MKH'lerin yüzey CXCR4 ifadelerinin önemli oranda azaldığı gösterilmiş ve enzimatik olmayan yöntemlerin CXCR4 ifadelerini daha iyi korunduğu tespit edilmiştir. Bağırsak anatomik olarak ince (duodenum, jejunum, ileum) ve kalın (çekum, çıkan kolon, tranvers kolon, inen kolon, sigmoid kolon ve rektum) bağırsaktan oluşmaktadır. Bağırsak mukozası, üzerini örten glikokaliks ile besinler, su ve küçük moleküllere seçici geçiş sağlarken, bakteriler ve patojenlere karşı güçlü bir bariyer oluşturmaktadır. Mukozanın yapısında epitel katını oluşturan goblet hücreleri (mukus salgılama), enteroendokrin hücreler (hormon salgılama) ve enterosit (emilim) bulunurken; Paneth (doğal immünite ve antibakteriyel savunma) hücreleri kript tabanında yer almaktadır. Kolon; villus bulunmaması, düz bir yüzeye sahip olması, Paneth hücrelerini içermemesi ve iki katlı mukus tabakası olması gibi özellikleriyle ince bağırsaktan ayrılmaktadır. Bağırsak epitel hücrelerinin devamlılığı, kript tabanında bulunan Lgr5+ intestinal kök hücre (İKH) tarafından sağlanmaktadır. Organoidler; kök hücre ve niş hücrelerini içeren, ufak, kendi kendiliğinden oluşabilen 3 boyutlu kültürlerdir. Bu organoidler izole edildikleri organa fonksiyonel benzerliklerinden dolayı“petri kabında organ”(organ-in-a-dish) olarak kabul edilmektedir. Organoidler; hücresel organizasyon ve işlevsellik yönünden orijinal (ilk elde edilen) dokunun en küçük fonksiyonel birliğine benzerlik göstermektedir. Bu özelliklerinden dolayı ilaç geliştirilmesi ve rejeneratif tıp amacıyla kullanılabilmektedir. Aynı zamanda bu organoidler, içinde bulunan kök hücrelerin özelliklerini ve mikroçevre/nişin rolünün araştırılması için kullanılabilmektedir. Yapılan ilk organoidler arasında intestinal organoidler bulunmaktadır. Bağırsak organoidleri, tek bir Lgr5+ İKH'den geliştirilebilir ve matriks molekülleri içeren matrijel ile kaplanmış kültür plakalarında 3 boyutlu olarak çoğaltılabilmektedir. Bağırsak organoidleri bağırsak epitelinden oluşan yapılardır ve bağırsakların in vitro modeli olarak kullanılabilmektedir. Kolon organoidler (kolonoid) kendini yenileme kinetiklerine sahiptir ve in vivo köken aldıkları kolona genetik ve fizyolojik olarak benzerlik göstermektedir. Bağırsak organoidleri, bağırsak epitelinin gelişimi ve özelliklerinin in vitro araştırmaları için önemli avantaj sağlamaktadır. Literatürde bağırsak mezenkimal hücrelerinin köklülüğü konusunda farklı görüşler bulunmaktadır. Ayrıca bağırsak mezenkimal kök hücrelerinin bağırsak dokusu dışında farklılaşma potansiyeli, yenileme potansiyeli ve immün modülatuvar potansiyeli daha önce kemik iliği MKH ile kıyaslanmamıştır. Bu bilgiler ışığında, ana hipotezimiz“İmmün yetmezliği olan Rag2 farelerinden elde edilen in vitro kolonoid modeller, aGvHD'nin in vivo fare modellerinde gözlemlenen hücresel ve moleküler hasarı uygun şekilde temsil eder mi?”, ardından ikincil hipotezimiz“B-MKH'ler, aGvHD'nin tedavisi için Kİ-MKH'ler kadar etkili midir?”şeklindedir. Bu tez kapsamında araştırma sorularını cevaplamak için: 1) DSS kullanarak immün yetmezliği olan Rag2 farelerinde bir İBH modelinin geliştirilmesi; 2) Düşük doz hazırlık rejimi ve MHC uyumsuz, aktive edilmiş B6 dalak T hücrelerinin infüzyonu kullanılarak immün yetmezliği olan Rag2 farelerinde bir aGvHD modelinin geliştirilmesi; 3) Bağırsak hasarının makroskobik ve mikroskobik değerlendirmesine dayanarak, tedavilerin etkisini ölçmek için bir skorlama sisteminin modifiye edilerek test edilmesi; 4) Sağlıklı Rag2 farelerinden kolonoidlerin üretilmesi ve kolonoidlerin aktive edilmiş B6 dalak T hücreleriyle birlikte kültür edilerek aGvHD'nin in vitro modellenmesi; 5) B-MKH'lerin eldesi sonrasında, morfoloji, immünofenotip, farklılaşma ve immünomodülatuvar açısından Kİ-MKH'lerle karşılaştırılması; 6) Kİ-MKH infüzyonlarının DSS kaynaklı İBH'de ve B-MKH veya Kİ-MKH'lerin infüzyonlarının T hücresi kaynaklı aGvHD farelerinde bağırsakta hasarlı bölgelere doğru göç etme kapasiteleri ve bağırsak hasarı semptomları üzerindeki etkilerinin karşılaştırılması amaçlanmıştır. Bu amaçlarla modellerin geliştirilmesinden sonra, 1) İmmün yetmezliği olan Rag2 farelerinde İBH ve aGvHD modellerinin oluşturulması; 2) İBH ve aGvHD fare modellerinde bağırsak hasarını ölçmek için bir puanlama sisteminin modifiye edilerek test edilmesi; 3) Rag2 fare kolonoidlerinde in vitro bir aGvHD modelinin oluşturulması; 4) aGvHD modelinde B-MKH'lerin etkilerinin Kİ-MKH'ler ile karşılaştırılması hedeflenmiştir. Bu tez kapsamında, fare B-MKH'leri ve Kİ-MKH'leri aynı farelerden izole edilip morfolojik ve immünofenotipik olarak karşılaştırılmıştır. Hücre yüzey belirteçleri açısından karşılaştırılmış ve CD29 ve CD44 ifadelerinin hem B-MKH'de hem de KİMKH'de yüksek olduğu belirlenmiştir. Ek olarak, her iki MKH tipinde hem CD90+ hem de CD90- hücre popülasyonları görülmüştür. Bağırsak belirteçleri değerlendirildiğinde, genel olarak B-MKH'ler ve Kİ-MKH'lerde ifade oranlarının benzer olduğu, ancak Gli-1 ifadesinin B-MKH'lerde Kİ-MKH'lerden daha düşük olduğu tespit edilmiştir. Bu çalışmada kontrol olarak kullanılan Op9 ve eGFP+ fare kökenli stromal hücre hatları, Kİ-MKH ve B-MKH'ler için tasarlanan aynı antikor paneli kullanılarak immünofenotiplendirilmiştir. Fare MKH'leri için optimum farklılaşma medyum protokollerini belirlemek için, Op9 hücrelerinde 21 gün boyunca belirlenen 6 farklı adipojenik farklılaşma medyumu (ADM) ve osteojenik farklılaşma medyumu (ODM) test edilmiştir. En yüksek düzeyde adipojenik ve osteojenik farklılaşma sağlayan ve aynı zamanda boyanmış kültürlerdeki ORO/ARS içeriğinin yarı kantitatif analiziyle de doğrulanan farklılaşma için ADM-3 ve ODM-1 formülasyonunun tez süresince kullanılmasına karar verilmiştir. Belirtilen farklılaşma medyumlar, ticari olarak temin edilen fare KİMKH Farklılaşma Kiti (R&D Systems) içerisinde bulunan medyumlarla karşılaştırılmıştır. B-MKH'ler ve Kİ-MKH'ler hem ADM-3 veya ODM-1 ile hem de kit içeriğindeki adipojenik veya osteojenik medyumlar ile 14 gün boyunca kültür edilmiştir. Genel olarak, Kİ-MKH ve B-MKH'lerin adipojenik ve osteojenik soya farklılaşma kapasiteleri benzer bulunmuştur. ADM-3 ve ODM-1 ile kültür edilen hücrelerin, R&D kit ile kültür edilenlerle karşılaştırıldığında, sırasıyla mFABP4 ve mOsteopontin'in daha parlak boyanmasıyla sonuçlanmıştır. Kondrojenik farklılaşma medyumu (CDM) için 3 farklı formülasyon Op9 stromal hücre hattı kullanılarak test edilmiştir. Kondrojenik farklılaşma için optimum medyum formülasyonu, 3D kıkırdak peletinin boyutuna ve Alcian mavisi ile boyama sonucunda glikozaminoglikanların varlığına göre seçilmiştir. Daha sonra, CDM-1, CDM-2 ve CDM-3 sırasıyla Stem Cell Technologies ve R&D kitleri ile karşılaştırılmıştır. Farklılaşma kapasiteleri gen ifade değişimleri değerlendirilerek karşılaştırılmış ve Sox9 gen ifadesi en yüksek CDM-3 ile kültür edilen hücrelerde tespit edilmiştir. Bu veriler ile kondrojenik farklılaşmalar için, hem TGF-b3 hem de IGF-1 içeren CDM-3 ile devam etmeye karar verilmiştir. Optimum farklılaşma koşullarımızı belirledikten sonra, seçilen farklılaşma medyumunun (ADM3, ODM-1 ve CDM-3) Op9 stromal hücrelerinin ve taze izole edilmiş Kİ-MKH'lerin gen ifadesi üzerindeki etkileri 1 haftalık farklılaşmadan sonra test edilmiştir. Genel olarak, taze izole edilmiş Kİ-MKH'lerin Op9 stromal hücre hattından daha iyi farklılaştığını ve adipojenik için Pparg, osteojenik için Alpl ve kondrojenik farklılaşma için Sox9 dahil olmak üzere test edilen üç soyun tüm belirteçlerinin hem Op9 hem de taze izole edilmiş Kİ-MKH'lerde arttığı tespit edilmiştir. Daha önce insan Kİ-MKH'lerin CXCR4 ifadesinin tripsin ile toplama sonucunda anlamlı olarak azaldığını göstermiştik. CXCR4 ifadesinin düşük olması hücrelerin göç (migrasyon) kapasitesini etkileyebileceğinden, transplantasyon deneylerinin başlatılmasından önce farklı enzimatik ve enzimatik olmayan toplama solüsyonlarının fare MKH canlılığı ve Cxcr4 ekspresyonu üzerindeki etkileri değerlendirilmiştir. Enzimatik toplama yöntemleri genel olarak yüksek canlılıkla sonuçlanırken, mekanik ve enzimatik olmayan toplama solüsyonları artan hücre ölümüyle ilişkilendirilmiştir. %0,25'lik Trypsin/EDTA kullanımı fare Kİ-MKH'lerin Cxcr4 yüzey ifadesinin azaltırken, enzimatik olmayan hücre toplama solüsyonu korumuştur. Bu nedenle, Cxcr4 ifadesinin Kİ-MKH göç kapasitesi üzerindeki önemini değerlendirmek için ön transplantasyon denemeleri, canlılık düzeylerinin belirlenmesi yapıldıktan sonra Cxcr4düşük ve Cxcr4yüksek hücre popülasyonları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Cxcr4 ifadesinin belirli inkübasyon sürelerinden sonra tekrar ortaya çıkıp çıkmadığını değerlendirmek için Kİ-MKH'ler tripsin edildikten sonra takip edilmiştir. Kİ-MKH'ler DF20 varlığında 37oC'de inkübe edildiğinde Cxcr4 ifadesinin yeniden oluştuğu, ancak 8 saat sonra hala tripsinizasyon öncesi seviyelerine ulaşılmadığı görülmüştür. Ancak, enzimatik olmayan solüsyonlarla toplandıktan sonra Cxcr4 ifadenin >%95 olduğu bulunmuştur. Bu veriler Kİ-MKH'lerin enzimatik yöntem ile toplanan hücrelerin infüzyonu sırasında Cxcr4 ifadesinin hala normal seviyelerin altında ve hasar bölgelerine doğru göçün ciddi şekilde etkilenebileceğini, nakledilen Kİ-MKH'lerin potansiyel rejeneratif veya immün modülatör etkilerini etkileyebileceğini göstermektedir. T hücreleri, Pan T hücre izolasyon kiti kullanılarak 10-12 haftalık erkek C57BL/6 farelerinin dalaklarından izole edilmiştir. İzolasyon sonrası CD3, CD4, CD8, CD19 ve CD45 oranları akım sitometre ile değerlendirilmiştir. CD3+ T hücresi yüzdesi, seleksiyon öncesi %26,2 ± 12,6 ve seleksiyon sonrası %84,2 ± 19,4'e kadar artmıştır. İzolasyonun sonrası, CD3+ T hücreleri 4 veya 7 gün boyunca aktive edilmiştir. T hücreler, farklı konsantrasyon ve kombinasyonlarda anti-CD3e, anti-CD28 ve ile inkübe edilerek 6 farklı medyumun etkileri test edilmiştir. T hücresi proliferasyonu ve klonal genişleme, CFSE testi ile belirlenmiştir. En uygun medyum T hücrelerinin bölünme sayısına göre değerlendirilmiştir. Hücrelerin 7 güne kadar uyarılması klonal ekspansiyonu artırmamış, ancak uzun süreli kültür hücre ölüm oranları artırmıştır. Bu nedenle, T hücre aktivasyonu için kültür ortamı 3 (CM3: DF-20, 5 ng/mL IL-2, 1 µg/mL CD3e ve 1 µg/mL CD28) ile literatürde fare T hücrelerinin stimülasyonu için en çok kullanılan 4 günlük stimülasyon/aktivasyona devam edilmesine karar verilmiştir. Kİ-MKH'lerin ve B-MKH'lerin immünomodülatuvar etkilerini karşılaştırmak amacıyla in vitro aktive edilmiş T hücresi proliferasyon baskılama testleri yapılmıştır. CFSE+/CD3+ T hücreler, 7 gün boyunca Kİ-MKH'ler veya B-MKH'ler ile kültür edilmiştir. MKH'lerin yokluğunda T hücresi proliferasyonu korunmuş ve aktive edilmiş T hücrelerinin floresan yoğunluğu, CM3'lü kontrol kuyularında azalmıştır. KİMKH'lerin immün baskılayıcı kapasitesinin, B-MKH'lerden çok daha güçlü olduğu, sadece %1 Kİ-MKH'li kültürlerde bile T hücresi çoğalma kapasitesinin önemli ölçüde bastırıldığı bulunmuştur. Bunun aksine, B-MKH'lerin T hücresi baskılanması için aynı ortamda en az %3 oranında bulunması gerektiği tespit edilmiştir. En güçlü immünosüpresif kapasiteler Kİ-MKH'lerde %3 ve B-MKH'lerde %10 olarak belirlenmiştir. Bu nedenle, in vivo fare deneylerinde, Kİ-MKH'lerden yaklaşık 3 kat daha fazla B-MKH enjekte etmeye hedeflenmiştir. Kİ-MKH'leri ve B-MKH'leri nakilden sonra izlemek için hücreler floresan boyalarla boyanmıştır. Bu boyaların floresanının dayanıklılığını değerlendirmek için Kİ-MKH'ler boyandıktan sonra 1, 4 veya 7 gün boyunca kültüre edilmiştir. Akım sitometri analizi, boyanmış hücrelerin floresan ışımada önemli bir kayıp olmadan in vitro 7 güne kadar izlenebileceğini göstermiştir. Kİ-MKH'lerin ve B-MKH'lerin kullanıldığı hastalık modellerinde nakilden sonra göç/rejeneratif/immünomodülatuvar etkilerinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. İlk olarak, daha önce yayınlanan çalışmamızda insan Kİ-MKH'lerini toplamak için klinikte kullanılan enzimatik yöntemlerin CXCR4 ifade kaybına yol açtığı bulunmuştur. Bu nedenle, farklı toplama yöntemlerinin fare MKH'lerinin Cxcr4 ifadelerini ve Cxcr4 ifade kaybının migrasyon/rejeneratif/immünomodülatuvar kapasitelerini etkileyip etkilemeyeceği değerlendirilmek istenmiştir. İkinci olarak, fare bağırsak hasarının histolojik incelenmesi için kullanılan mevcut protokoller ya yeterince ayrıntılı olmadığı için ya da fareler yerine insan kullanımı için tasarlanmış olduğundan dolayı mevcut skorlama sisteminin hasar modelimize uygun olacak şekilde modifiye edilmesi ve doğrulamak için İBH modelinin kullanılması planlanmıştır. Rag2 farelerde İBH indüklenmesi için, %3 DSS içme sularına eklenmiş ve fareler 5 gün boyunca izlenmiştir. Tüm fareler, DSS uygulamasından 5 gün sonra kolit benzeri semptomlar göstermiş ve kolitin şiddetinin nakilden önce orta düzeyde olduğu bulunmuştur (disease activity index, DAI skoru 7,0 ± 1,7). İBH'nin doğrulanmasından sonra, farelere Cxcr4düşük veya Cxcr4yüksek Kİ-MKH'ler i.p. nakil edilmiş ve fareler 7 gün boyunca değerlendirilmiştir. Nakledilen fareler günlük olarak izlenmiş; ishal, rektal kanama ve vücut ağırlığında azalma gibi kolit-benzeri klinik belirtiler, her iki tedavi grubunda da hafifletilmiştir. Cxcr4yüksek grubunun DAI skoru 0,3 ± 1,5 (p0.05), Kİ-MKH naklinin bağırsak geçirgenliği üzerindeki etkileri ve kolonların morfolojik görünümü, Kİ-MKH'lerin kolon üzerinde güçlü bir rejeneratif veya koruyucu etkisi olduğunu düşündürmektedir. Kİ-MKH'lerin koruyucu etkilerini histolojik olarak değerlendirmek için, tüm farelerin çıkan, transvers ve inen kolonları H&E ile boyanmıştır. Cxcr4düşük veya Cxcr4yüksek Kİ-MKH'lerin nakli, nakledilmemiş DSS pozitif kontrollerine kıyasla, inflamatuvar hücre infiltrasyonu (p2, aGvHD derecesi 2 ve üzeri) daha sonra 1x106 BM-MSC (n=3) veya 2,3 x106 I-MSC (n=3) ile tedavi edilmiştir ve 7 gün daha takip edilmiştir. MKH infüzyonundan 7 gün sonra, klinik değerlendirme tekrarlanmış ve tedavi öncesi ve sonrası aGvHD derecesi belirlenmiştir. İBH modeliyle elde edilen verilere dayanarak, infüzyon için hazırlanan MKH'ler standart Trypsin/EDTA toplama yöntemi ile toplanmıştır. B-MKH enjekte edilen iki fare, büyük olasılıkla emboli (hava veya hücre kümeleri) nedeniyle infüzyon sırasında öldüğünden toplam B-MKH'lerle tedavi edilen yalnızca bir farenin verileri kullanılmıştır. Hayvanlar sakrifiye edildikten sonra donör kaynaklı lenfositlerin varlığı periferik kan, kemik iliği ve dalaklar da analiz edilmiştir. Rag2 farelerde T ve B hücreleri bulunmadığından T hücre infüzyon sonrası dokularda bulunan tüm T hücrelerin donor kaynaklı olması beklenmektedir, ancak hematopoetik kök hücre nakli yapılmadığından varolan T hücre sayıları sınırlı olması beklenmektedir. Akım sitometri verilerimize dayanarak, hematopoetik dokuların hiçbirinde yüksek düzeyde T hücresi tutunması tespit edilmemiştir. BU'nun (aGvHD negatif kontrol, n=4), BU + T hücrelerinin (aGvHD pozitif kontrol, n=3), BU + T hücrelerinin + Kİ-MKH'lerin (Kİ-MKH tedavi grubu, n=3) ve BU + T hücrelerinin + B-MKH'lerin (B-MKH tedavi grubu, n=1) bağırsak geçirgenliği üzerindeki etkilerini değerlendirmek için, hayvanlara oral yoldan FITC-Dekstran verilmiş ve 4 saat sonra serumdaki FITC-Dekstran düzeyleri T hücresi tedavisinden sonraki 7. günde ve 14. günde (MSC naklinden sonraki 7. günde) floresan spektrometrisi kullanılarak değerlendirilmiştir. Rag2 farelerinin BU ile tedavisi, tedavi edilmeyen kontrollerle karşılaştırıldığında kilo kaybına ve bağırsak geçirgenliğinde orta düzeyde bir artışa (p0,05) göstermiştir, ancak Rag2 tedavi edilmemiş kontrol grubuna göre önemli ölçüde daha fazla epitel hasarı (p
Özet (Çeviri)
Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation is the only curative treatment option for a number of hematological diseases, whether they are malignant or non-malignant. Graft versus host disease (GvHD) occurs after allo-HSCT due to a generalized response of donor-derived T cells to human leukocyte antigen HLA proteins on the surface of recipient cells. Preclinical studies aimed at a better understanding of the pathophysiology of aGvHD require the use of many mice and result in considerable discomfort in the mice and may even lead to death. Therefore, in the framework of this thesis, we aimed to develop alternative intestinal aGvHD models that would induce less harm, while still functioning as a representative disease model. In order to be able to assess the clinical effects of our model, we generated a mouse model of Inflammatory Bowel Disease (IBD) using DSS treatment of immunodeficient Balb/c-Rag2-/- (Rag2) mice to develop a general scoring system for intestinal damage. We then developed an in vivo and in vitro model of intestinal aGvHD using a low intensity BU-based conditioning regimen in Rag2 mice and Rag2 derived colonoids, respectively. Using these models, we tested the effects of bone marrow and intestinal mesenchymal stromal/stem cells on aGvHD severity, and assessed their migratory, immune modulatory and regenerative potential. We found that the use of the Rag2 intestinal aGvHD model offers a great advantage in studying intestinal damage in the absence of overt other tissue involvement, requiring less animals for use. In addition, the in vitro aGvHD-in-a-dish model of can be used to model intestinal aGvHD and shows great similarity to the in vivo model.
Benzer Tezler
- Development of mirna biomarkers for the differentiation between gingivitis and periodontitis: A pilot study
Gingivitis ve periodontitis ayrımı için mirna biyobelirteçlerinin geliştirilmesi: Pilot çalışma
DHAFIR LATIEF FAYADH FAYADH
Doktora
İngilizce
2023
BiyokimyaSüleyman Demirel ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MUSTAFA CALAPOĞLU
- İnce bağırsak iskemi reperfüzyon hasarında tirofibanın etkilerinin incelenmesi
The investigation of effects of tirofiban on small intestine ischemia and reperfusion injury
SÜMEYRA ERCAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
FizyolojiZonguldak Bülent Ecevit ÜniversitesiFizyoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ İNCİ TURAN
- Hem oksijenaz-1'in deneysel kolit üzerine etkileri
The effect of the hem oxygenase-1 in the experimental colitis
CUMHUR DEĞER
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2005
Genel Cerrahiİstanbul ÜniversitesiGenel Cerrahi Ana Bilim Dalı
DOÇ.DR. YEŞİM ERBİL
- Taurinin deneysel kolit modellerinde kolon mukozası üzerine etkisi
The effect of taurin on colonic mucasa in the experi̇mental colitis
BÜNYAMİN GÜRBULAK
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2005
Genel Cerrahiİstanbul ÜniversitesiGenel Cerrahi Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MAZHAR ALP BOZBURA
- Deneysel kolon anastomozu modelinde oluşturulan iskemi-reperfüzyon hasarı üzerine düşük molekül ağırlıklı heparin'in (enoxaparin) etkileri
The effect of low molecular weight heparin (enoxaparin) on occured injury of ischmia-reperfüsione in experimental colonic anastomosis model
TOYGAR SARI
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2015
Genel CerrahiAnkara ÜniversitesiGenel Cerrahi Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ENDER HİLMİ KOCAOĞLU