Exploring molecular mechanisms that underlie regulation of transcription factor NFIB by the peptidyl prolyl isomerase pin1
NFIB transkripsiyon faktörünün peptidil prolil isomeraz PIN1 tarafından regülasyonunun moleküler mekanizmalarının araştırılması
- Tez No: 941178
- Danışmanlar: DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyokimya, Biyoloji, Genetik, Biochemistry, Biology, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 129
Özet
Embriyonik gelişim pek çok transkripsiyon faktörü ve farklı sinyal yolaklarının birlikte ve uyum içerisinde çalışmasını gerektiren kompleks olaylardan oluşmaktadır. Omurgalılarda embriyonik gelişimde önemli rol oynayan transkripsiyon faktörlerinden birisi de NFIB'dir. NFIB, Nükleer Faktör I (NFI) ailesinin bir üyesidir. NFI ailesi, NFIB'nin haricinde NFIA, NFIC ve NFIX olmak üzere 4 üyeden oluşmaktadır. Her bir üye, üyeler arasında yüksek derecede korunmuş olan N-ucu DNA bağlanma bölgesi ve daha az korunmuş olan C-ucu transkripsiyonel aktivasyon/represyon bölgesi içermektedir. DNA bağlanma bölgesine kıyasla benzerliği daha az olsa da, NFI proteinleri arasında C-ucu bölgeleri de kısmen korunmuştur. NFI ailesi üyelerinin rolleri farelerde yapılan gen susturması çalışmaları ile aydınlatılmıştır. Bu çalışmalar, NFIA, NFIB ve NFIX'in merkezi sinir sistemi gelişiminde özellikle glial farklılaşma için gerekli olduklarını, eksikliklerinin nöral progenitor hücrelerinin farklılaşmasında gecikmeler dolayısıyla lateral ventriküllerin genişlemesi ve korpus kallozumun oluşumunda bozukluklar gibi belirgin ve örtüşen fenotiplere yol açtığını göstermiştir. Merkezi sinir sistemi haricinde NFIA'nın böbrek ve idrar yolu gelişiminde, NFIB'nin akciğer gelişiminde, NFIX'in ise iskelet kas sistemi gelişiminde önemli roller oynadıkları ortaya konmuştur. İlginç olarak NFIC'nin merkezi sinir sistemi gelişimini düzenlediğine dair bir veri bulunmazken, kemik kök hücrelerinin farklılaşmasında ve dahası diş kökü gelişiminde rol oynadığı bildirilmiştir. NFI proteinlerinin amino asit dizisinin yüksek derecede korunmuş olması ve merkezi sinir sistemi gelişiminde ortak düzenleyici rollerinin olması; genel olarak işlevlerinin de ortak olduğu, ortak düzenleme mekanizmalarına tabi oldukları ve ifade edildikleri dokularda birbirleri yerine geçebilecekleri görüşünü desteklemektedir. Farklı doku/organlarda sadece bir NFI için tespit edilmiş spesifik rollerin gözlenmesi, aile üyelerinin farklı düzeylerde ifade edilmeleriyle ilişkili gibi görünse de, her bir NFI proteinin farklı düzenlenme mekanizmalarına tabi tutulmasıyla da meydana gelebilir. Örneğin akciğer dokusunda tüm NFI proteinlerinin ifade edilmesine rağmen sadece NFIB eksikliğinde akciğer gelişiminin etkilenmesi, üyelerin birbirinden bağımsız ve benzersiz şekilde düzenlenme ihtimalini desteklemektedir. NFI proteinlerinin aile üyeleri arasında korunmuşluğu daha düşük olan C-ucu bölgeleri yoluyla farklı proteinler ile etkileşime girme ve farklı şekilde regüle edilme ihtimali vardır. Ancak NFI proteinlerinin etkileşime girdiği proteinler, NFI proteinlerinin çeşitli düzenleyici proteinler tarafından kontrolü ve ilgili moleküler mekanizmalar hakkındaki bilgi oldukça kısıtlıdır. NFI proteinlerinin embriyonik gelişimdeki rolleri ile ilintili olarak, ifadelerinin veya fonksiyonlarının değişmesinin kanser oluşumu ve ilerlemesi ile ilişkili olduğu tespit edilmiştir. Gerçekten de glial farklılaşmayı tetikleyen NFI proteinlerinin glioma tümörlerinde tumor baskılayıcı olarak rol aldığı, bu tümörlerde NFI ifadesinin artırılması ile tümör büyümesinin yavaşladığı pek çok çalışmada gösterilmiştir. Bunun aksine, ifade edildikleri hücre özelinde NFI ifadesinin artması ile glioma da dahil olmak üzere pek çok tümörde onkogen olarak rol oynadığı da gösterilmiştir. Bu bilgiler NFI proteinlerinin bağlama göre değişebilen rollerinin ve bağlama özgü çeşitli düzenleyici proteinler tarafından düzenlenme mekanizmalarının aydınlatılmasının gerekliliğini vurgulamaktadır. NFI proteinlerinin işlevlerini düzenleyen yeni proteinlerin keşfi amacıyla, daha önce laboratuvarımızda maya ikili hibrit taraması yapılmıştır. Bu deneyin sonucunda bulunmuş olan, NFIB'nin fonksiyonunu kontrol etme potansiyeli yüksek olan aday proteinlerden birisi de PIN1'dir. PIN1 her hücrede ifade edilen bir peptidyl-prolil izomerazdır. PIN1 hedef proteinler ile Ser/Thr-Pro amino asitleri aracılığı ile çoğunlukla fosforilasyona bağımlı şekilde etkileşmektedir. Hedef proteinlerin izomerizasyonu ve konformasyon değişikliği tetiklenerek, bu proteinlerin kararlılığı, transkripsiyonel aktivitesi, DNA'ya bağlanma afinitesi, hücre içi lokalizasyonu gibi özellikleri değişmektedir. Dolayısıyla, bir proteinin fosforilasyona bağımlı şekilde PIN1 tarafından tanınması ve izomerizasyonu, hedef proteinlerde fosforilasyon sonrasında meydana gelen yeni bir modifikasyon olarak anılmaktadır. PIN1 aynı zamanda Ser-Pro gibi her proteinde sıklıkla bulunabilen ve fosforilasyona tabi olabilen bir motifi tanıması nedeniyle prolin-yönlendirilmiş kinazların yönettiği sinyal yolaklarının kesişiminde de rol oynamaktadır. Farklı görevleri üstlenmiş çok sayıda proteini regüle etmesi sebebiyle, PIN1 hücre çoğalması ve farklılaşması da dahil olmak üzere, hücre içerisinde çok çeşitli süreçlerle ilişkilidir. Bu nedenle çeşitli nörolojik bozukluklar veya kanser oluşumu sürecinde PIN1'in ifadesinin ve/veya aktivitesinin değişmesi ile sıklıkla karşılaşılmaktadır. PIN1'in pek çok kanserde aktivitesinin ve ifadesinin artması, ayrıca tumör baskılayıcı proteinlerin kararlılığını azaltırken onkogen proteinlerin kararlılığını artırması gibi özellikleri PIN1'e onkogen rolü kazandırmaktadır. Ayrıca sinyal yolaklarını tek bir modifikasyon ile yönetebilme kapasitesi, PIN1'i terapötik yaklaşımların hedefi haline getirmektedir. PIN1'in karsinogenezde aktif rollerinin olması, nöral kök hücrelerde ifade edilmesi ve nörogenezi tetiklemesi gibi NFIB'ninki ile örtüşen rollerinin olması, ayrıca pek çok transkripsiyon faktörünü de regüle edebilmesi, NFI üyeleri arasında amino asit dizisi korunmuşluğu düşük olan C-ucu bölgelerinin prolince zengin olması nedeniyle; PIN1'in, NFIB'nin de fonksiyonunu regüle edebilme potansiyeli yüksek bir protein olduğu düşünülmüştür. Bu nedenle araştırılmak üzere NFIB etkileşim adayı olarak PIN1 seçilmiştir. Bu çalışmada HEK293T hücrelerinde ifadeleri artırılan NFIB ve PIN1 proteinlerinin birbirleri ile fiziksel olarak etkileşime girdikleri immunopresipitasyon ve GST çöktürme deneyleri ile araştırılıp gösterilmiştir. Ayrıca PIN1'in NFI ailesinin diğer üyeleri, NFIA, NFIC, ve NFIX ile de bağlanabildiği, tüm NFI proteinleri için ortak bir etkileşim partneri olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca yüksek düzeylerde NFIB ifade eden SH-SY5Y nöroblastoma hücrelerinde endojen PIN1'in de NFIB'ye bağlandığı tespit edilmiştir. NFI proteinlerinde hem N-ucu hem de C-ucu bölgeleri üzerinde korunmuş olan Ser-Pro dizileri mevcuttur. İmmunopresipitasyon çalışmaları PIN1'in NFI proteinlerine, aile üyeleri arasında korunmuş olan N-ucu DNA'ya bağlanma bölgesi aracılığı ile bağlandığını göstermiştir. PIN1 NFIB'nin C-ucu bölgesine bağlanmamaktadır. NFIB-PIN1 etkileşiminin NFIB üzerinde hangi amino asitler aracığı ile gerçekleştiğini anlamak amacıyla öncelikle NFIB defosforile edilerek, PIN1 etkileşimi test edilmiştir.Defosforile edilen NFIB'nin daha az PIN1 çöktürdüğü gözlemlenmiştir. Bu veri NFIB-PIN1 etkileşiminin fosforilasyona bağımlı olduğunu göstermektedir. Ardından, NFIB'nin hangi amino asit kalıntıları üzerinden fosforile olduğu bilinmediğinden, tüm NFI proteinleri arasında korunmuş olan Ser-Pro, Thr-Pro amino asit kalıntıları mutasyon aracılığı ile Ala-Pro'ya çevrilmiştir. Ancak elde edilen bulgular, NFIB'nin PIN1 ile etkileşiminin değişmediğini göstermektedir. Daha sonra, NFIB N-ucu bölgesi üzerinde delesyonlar yaparak elde edilen delesyon mutantlarının PIN1 ile bağlanması incelenmiştir. Analizler sonucunda özellikle NFIB'nin amino asit dizisinde 167 ve 208 pozisyonları arasında kalan bölgenin silinmesi ile PIN1 bağlanmasının azaldığı gözlenmiştir. Ayrıca aynı bölgenin PIN1'e bağlanmayan NFIB_C ucuna eklenmesi ile elde edilen yeni mutant protein PIN1 ile etkileşmektedir. Bu veriler NFIB proteini üzerindeki 167-208 pozisyonları arasında kalan amino asitlerin PIN1'in NFIB'ye bağlanmasında önemli olduğunu göstermektedir. Ayrıca moleküler yakınlaştırma çalışmaları dimer NFIB'nin monomer NFIB'ye göre yeni PIN1 bağlanma yüzeyleri taşıdğı, her iki koşulda da PIN1'in NFIB'ye hem WW bölgesi hem de PPIaz bölgesi aracılığı ile yakınlaştığı gösterilmektedir. Yakınlaşan bölgeler arasında tüm NFI üyeleri arasında korunmuş olan ve 167-208 amino asit dizileri arasında olan kalıntılar da bulunmaktadır. Ancak delesyon mutantlarının dimerleşme kapasiteleri bu çalışmada test edilmemiştir. Bu nedenle dimer oluşturmadıkları düşünülürse, bu mutantlardan elde edilen bağlanma bölgeleri verileri doğal olarak dimer oluşturan NFIB üzerinde yer alan ve PIN1 bağlanması için gerekli olan dizileri tam olarak yansıtmayabileceği unutulmamalıdır. Deneysel olarak PIN1'in NFIB'ye bağlanmasında WW bölgesinin gerekli olduğu gösterilmiştir. Her ne kadar PIN1'in PPIaz bölgesinde de mutasyon yapılmış olsa da, test edilen mutantlar moleküler yakınlaştırma çalışmasında tespit edilenler ile aynı değildir. In silico olarak elde edilen verilerin deneysel olarak doğruluğu ileriki çalışmalarda test edilebilir. Bu bilgiler ışığında PIN1'in NFIB'nin ve diğer NFI üyeleri için yeni bir bağlanma partneri olduğu ve potansiyel olarak NFI proteinlerinin fonksiyonunu düzenleyebileceği belirlenmiştir. Ardından PIN1'in NFIB işlevi üzerine bir etkisinin olup olmadığı araştırılmıştır. Bu amaçla NFI proteinlerinin gliogenez sırasında aktive ettiği bilinen bir gen olan GFAP seçilip, PIN1 varlığı ve yokluğu koşullarında NFIB'nin GFAP promotoru kontrolündeki lusiferaz haberci geni aktivasyonuna olan etkisi araştırılmıştır. Sonuç olarak NFIB varlığında GFAP promotorunun aktive olduğu, ancak PIN1 varlığında GFAP-lusiferaz aktivasyonunda belirgin bir azalma olduğu tespit edilmiştir. Buna ek olarak NFIB'nin baskıladığı bilinen p21 ve Hes1 promotorlarının NFIB-PIN1 etkileşiminden nasıl etkilendiği araştırılmıştır. Beklendiği şekilde, NFIB'nin her iki promotoru da baskıladığı, ancak bu baskılanmanın PIN1 varlığında durdurulduğu gösterilmiştir. Hem promotor aktivasyonunun hem baskılanmasının test edildiği koşullarda NFIB ile etkileşen PIN1 mutantı (PIN1-K63A) promotor aktivitesini PIN1 ile benzer şekilde etkilerken, NFIB ile etkileşemeyen PIN1 mutantı (PIN1-W34A) NFIB'nin transkripsiyon aktivitesini etkilememektedir. Buna ek olarak, pek çok proteinin kararlılığını da düzenleyen PIN1'in NFIB kararlılığı üzerindeki etkisi araştırılmıştır. Bu çalışmada, PIN1 ifade düzeyinin artırılması ile NFIB'nin daha kararlı hale geldiği tespit edilmiştir. Endojen seviyede PIN1 ifade edilen koşul ile kıyaslandığında PIN1'in susturulması istatistiksel olarak anlamlı bir farka sebep olmamıştır. Ancak yine de, bulgular PIN1'in susturulması ile NFIB kararlılığının azaldığına işaret etmektedir. Böylece, bu bulgular, PIN1'in tetiklediği konformasyonel değişikliğin NFIB'nin transkripsiyonel aktivasyonunu baskıladığı ancak aynı zamanda kararlılığını artırdığına işaret etmektedir. NFIB'nin PIN1 varlığı ve yokluğu koşulunda ubikitinasyonu ve degredasyonu nasıl etkilendiği ileriki dönem çalışmaları ile aydınlatılabilecektir. Bu çalışmada PIN1'in sadece NFIB fonksiyonuna olan etkisi incelenmiştir. Ancak PIN1'in diğer NFI proteinleri ile etkileşiminin sonuçlarının da araştırılması bilgilendirici olacaktır. Ayrıca NFIB'nin fosforile olduğu kalıntıların belirlenmesi de PIN1'in bağlandığı dizilerin tespit edilmesi açısından önemli olabilir. Bunlara ek olarak PIN1'in NFIB konformasyonuna olan etkisi de ileriki çalışmalar ile aydınlatılabilir. Her iki protein glia hücrelerinde ifade edilmektedir. Ayrıca glial tümörlerde ifade düzeylerinin yanlış düzenlendiği veya fonksiyonlarının bozulduğu bilinmektedir. GFAP glial hücreler için bir farklılaşma efektör proteinidir; buna ek olarak glioma hücrelerindeki GFAP düzeyinin tümör karakteri ile ilişkili olduğu bilinmektedir. Düşük düzeyde GFAP ifadesinin glioma kanseri hücrelerine agresif karakter kazandırmasının aksine, yüksek düzeyde GFAP ifadesi gliomada daha iyi karakter ile ilişkilendirilmiştir. PIN1 varlığında NFIB'nin GFAP ifadesini tetikleyememesi göz önüne alındığında, PIN1-NFIB-GFAP ekseninin gelişim sırasında veya karsinogenezde etkin bir rolü olup olmadığı da ileriki çalışmalarda araştırmaya değer diğer önemli bir konudur.
Özet (Çeviri)
Embryonic development entails complex cellular events regulated by a variety of signaling pathways and coordinated actions of numerous transcription factors. One of these transcription factors is Nuclear Factor One B (NFIB) of the NFI family, which includes three other members (NFIA, NFIC, and NFIX) in vertebrates. Each NFI has a well-conserved N-terminal DNA binding and dimerization domain along with a less conserved transactivation and repression domain. Knockout studies have shed light on NFI function during development. The phenotypes of knockout mice demonstrated that the absence of NFIA, NFIB, or NFIX causes severe developmental defects in CNS characterized by enlarged lateral ventricles and abnormal corpus callosum development arising from failure in neural progenitor cell differentiation. Consequently, neural and neuronal differentiation programs are also delayed. In addition, the absence of NFIB leads to respiratory defects in mice due to abnormal lung development, while NFIX deletion results in skeletal muscle system anomalies. NFIA, on the other hand, plays a role in the development of urinary tract and kidney. In contrast to the other members, the absence of NFIC does not apparently affect CNS development. Instead, it regulates osteoblast differentiation and is essential for tooth root development. Overall, these phenotypes indicate that the NFI family is an important regulator of CNS development, as well as other organ systems. However, the precise regulatory mechanisms involving interaction partners are poorly understood. Previously, a yeast two-hybrid (Y2H) screen was performed to find novel interaction partners that regulate NFI function; this screen identified PIN1 as a potential NFIB-binding protein. PIN1, a cis-trans peptidyl-prolyl isomerase, plays an important role in various molecular pathways such as gene expression, DNA repair and it regulates numerous proteins with diverse functions. These include transcription factors, enzymes, tumor suppressors, oncogenic proteins, and other regulatory proteins. Consequently, it has been implicated in control of cell proliferation, differentiation, metabolism, cancer, drug resistance, genomic instability, metastasis, and apoptosis as well as survival. PIN1 recognizes phosphorylated Ser/Thr-Pro residues and modulates protein function, DNA binding affinity, stability, and subcellular localization. Since kinases or phosphatases also bind these recognition sequences, PIN1 serves as an important mediator in the communication of various signaling pathways. Additionally, PIN1 often enhances stability of oncogenic proteins while decreasing the half-life of tumor suppressors. Moreover, elevated PIN1 expression and/or activity is frequently observed during tumorigenesis, distinguishing PIN1 as an oncogene. NFI family members carry PIN1 recognition motifs within their N- and C-terminal domains, both NFIB and PIN1 are expressed in neural progenitor cells during embryonic development, thereby involved in regulation of neurogenesis. Misregulation of both proteins is implicated in development of cancer including glioblastoma multiform. As both proteins are likely to act in the same cellular and developmental pathways, we focused on PIN1 as a potential NFIB upstream regulator. To investigate PIN1-NFIB interaction, I overexpressed both proteins in HEK293T cells and conducted GST pull-down and immunoprecipitation assays. These experiments revealed that when overexpressed, NFIB, along with other NFI members, interacts with PIN1. NFIB-PIN1 interaction requires the conserved NFI N-terminal DBD domain and the WW domain of PIN1. More specifically, the region spanning residues 167-208 on NFIB serves as the main target of PIN1. However, point mutations converting conserved Ser/Thr-Pro motifs to Ala-Pro, including those in the 167-208 region, failed to abolish NFIB-PIN1 interactions. Furthermore, I determined that NFIB-PIN1 binding occurs in a phosphorylation-dependent manner, as CIP treatment significantly decreases the interaction. In summary, I posit that while the N-terminal DBD domain is required for PIN1 binding, non-canonical phosphorylation sequences may also contribute to the interaction. Subsequently, I investigated whether NFIB function is regulated by the presence of PIN1. To this end, I measured luciferase activity driven by GFAP promoter, since NFIB, as well as other NFIs, enhance GFAP expression. I found that GFAP activation decreased in the presence of both NFIB and PIN1, whereas the PIN1 mutant (PIN1-W34A), unable to bind NFIB, did not exhibit such an inhibitory effect. One of the known functions of PIN1 is regulation of protein stability. Therefore, I measured the half-life of NFIB in the presence or absence of PIN1 and found that PIN1 increases that of NFIB's. Collectively, these results suggest that PIN1 induces a conformational change in NFIB, resulting in decreased transcriptional activity while simultaneously increasing its stability. However, the potential involvement of the ubiquitin-proteasome degradation system in regulating NFIB's stability, or the contribution of the PIN1-NFIB-GFAP axis to tumorigenesis remains to be further characterized. The induction of GFAP is one of the hallmarks of glial differentiation. Moreover, its high expression is generally associated with less aggressive tumor characteristics, whereas low GFAP levels are often observed in more aggressive tumors and are associated with poor prognosis in glioma patients. Since both NFIB and PIN1 are required for correct development of CNS and their misregulation of both proteins is also implicated in tumorigenesis, the physiological relevance of the PIN1-NFIB-GFAP axis and its involvement in the etiology of various disease need to be further investigated.
Benzer Tezler
- Exploring the factors modulating the solubilization of β-carotene in dietary mixed micelles through computer simulations
Besidüzensel karma misellerinde β-karotenin çözülmesini etkileyen faktörlerin bilgisayar benzetimleri ile araştırılması
ESRA TUNÇER
Doktora
İngilizce
2018
Gıda Mühendisliğiİzmir Yüksek Teknoloji EnstitüsüGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ BESTE BAYRAMOĞLU
- Exploring NFIB phosphorylation motifs and signaling pathways upstream of NFI phosphorylation in glioblastoma cell lines
Glioblastoma hücre hatlarında NFIB fosforilasyon motiflerinin ve NFI fosforilasyonundan yukarı yöndeki sinyal yollarının araştırılması
ELİF DİLEK
Yüksek Lisans
İngilizce
2025
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR
- Investigation of cobalt resistance in Rhodobacter sphaeroides at molecular level
Rhodobacter sphaeroides'de kobalt direncinin moleküler düzeyde incelenmesi
GÜNEŞ ATAY
Doktora
İngilizce
2024
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
- İnsan meme kanseri hücrelerinde Cucurbitasin-I ve abraxane' ın antiproliferatif etkileri
Antiproliferative effects of Cucurbitasin-I and abraxane in human breast cancer cells
NEVAL ÇEP
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
Biyoteknolojiİstanbul ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MEHMET RIFKI TOPÇUL
- Non-obstrüktif azoospermi olgularının sertoli hücrelerinde mitokondriyal dinamiğin incelenmesi
Investigation of mitochondrial dynamics in sertoli cells of nonobstructive azoospermia cases.
NAZILA FARHANGZAD