Exploring NFIB phosphorylation motifs and signaling pathways upstream of NFI phosphorylation in glioblastoma cell lines
Glioblastoma hücre hatlarında NFIB fosforilasyon motiflerinin ve NFI fosforilasyonundan yukarı yöndeki sinyal yollarının araştırılması
- Tez No: 935867
- Danışmanlar: DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 93
Özet
Glioma, beyin ve omurilikteki glia hücrelerinden kaynaklanan, en yaygın birincil beyin tümörüdür. Bu tümörler, histolojik ve moleküler özelliklere göre çeşitli alt türlere ayrılır ve glioblastoma (GBM) alt türlerin en agresif formudur. Gliomalar, Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından dört gruba ayrılmıştır: I. derece (en az agresif) ile IV. derece (en malign). IV. derece gliomalar, özellikle GBM, yüksek proliferasyon, vaskülarizasyon ve nekroz ile ilişkilendirilmiştir. GBM, primer ve sekonder türlere ayrılır. Primer GBM'lar, çoğunlukla“de novo”gelişirken, sekonder GBM daha düşük dereceli gliomlardan evrilir ve genellikle genç hastalarda görülür. Primer GBM, EGFR, PTEN ve PI3K/AKT/mTOR sinyal yollarında mutasyonlarla, sekonder GBM'lar ise çoğunlukla TP53, IDH1 ve diğer tümör baskılayıcı genlerdeki mutasyonlar sonucu oluşur. GBM'nın moleküler sınıflandırılması, biyolojisini anlaşılmasında önemli bir rol oynamış ve hedefe yönelik tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesini sağlamıştır. Nükleer Faktör I (NFI) proteinleri, beyin gelişimi ve gliogenezde kritik düzenleyici görev yapan bir transkripsiyon faktör ailesidir. NFI ailesi, dört üyeden oluşur: NFIA, NFIB, NFIC, NFIX. NFI proteinleri N-uçlarında yüksek homoloji taşıyan DNA bağlanma ve dimerizasyon bölgesi C-uçlarında ise daha az korunmuş transkripsiyon aktivasyon/baskılama bölgesi bulunur. NFI'lerin rolü HeLa hücrelerinde adenovirus replikasyonu için gerekli proteinler olarak tanımlanmıştır. Ancak yakın zamanda yapılan çalışmalar, NFIB'nin hücre döngüsü esnasında, DNA replikasyonu için gereken kromatin erişilebilirliğini artırdığını göstermiştir. Glia farklılaşma belirteçleri olan NF-M, GFAP, ve MBP proteinlerinin ifadesi doğrudan NFI'ler tarafından tetiklenmektedir. NFI nakavt fare modelleri, NFI'lerin beyin gelişimi ve gliogenezdeki rolününün anlaşılması için değerli bilgiler sunmuştur. Bu farelerde, korpus kallosum'un oluşmaması, hidrosefali ve diğer gelişimsel anormallikler gibi önemli nöroanatomik defektler gözlemlenmiştir. Özellikle Nfia ve Nfib ifadesinin kaybı, glia hücre oluşumunda bozukluklara yol açmakta ve beyin yapısında defektlere neden olmaktadır. Yetişkinlerde ise, NFI'lerin genel olarak kök hücre proliferasyonu ve farklılaşması arasındaki dengeyi kontrol ettikleri düşünülmektedir. Durgun nöral kök hücrelerde, NFI motiflerinin gen düzenleyici bölgelerde bulundukları tespit edilmiş ve özellikle NFIX'in işlev kaybı ve kazancının, hücre durgunluğu için gereken gen ifadesini tetiklediği gösterilmiştir. NFIX aynı zamanda hematopoetik kök hücrelerin farklılaşmasını indükleyerek, öncül hücrelerin miktarını düzenlemektedir. NFIB ise saç kökü nişinde, epitel ve melanosit kök hücrelerin çoğalma, hayatta kalım ve farklılaşmasını kontrol etmektedir. NFI'lerin genel olarak kök hücre yenilenmesi ile ilgili genleri baskılayarak (örneğin epigenetik regülatör, EZH2), farklılaşma ile ilgili genleri aktive ettikleri görülmektedir. NFI'lerin kanserlerdeki rollerinin hücre tipine ve kontekste bağlı olduğu görülmektedir; bazı çalışmalar, NFI'lerin tümör baskılayıcı olarak davrandığını raporlarken, diğerleri onkogenik potansiyellerini saptamışlardır. Özellikle NFIA, mesane kanserinde bir tümör baskılayıcı olarak tanımlanmıştır, NFIA ifade artırımı tümörün ilerlemesini yavaşlatmaktadır. Buna karşılık, NFIB'nin onkogenik özelliklere sahip olduğu küçük hücreli akciğer kanseri ve meme kanseri gibi birçok kanser türünde gösterilmiştir. NFIB'nin ekspresyonu, çeşitli kanserlerde kötü prognoz ve tümör agresifliği ile ilişkilendirilmiştir ve NFIB ifade artırımı hücre proliferasyonunu, migrasyonunu ve invazyonunu indükleyebilmektedir. Bununla birlikte, NFIB bazı durumlarda tümör baskılayıcı olarak da hareket etmektedir; örneğin, akciğer adenokarsinomunda, NFIB ifadesi hasta sağkalımı ile ters orantılıdır. NFIB'nin farklı kanser türlerinde paradoksal karakterli işlevleri, hastalık üzerindeki etkilerinin tümör mikroçevresi, genetik mutasyonlar ve hastalık aşaması gibi faktörlere bağlı olarak değişebileceğini düşündürmektedir. NFI'lerin, glia hücrelerin gelişimi ve proliferasyonu sırasında oynadıkları roller nedeniyle gliomalarla olan ilişkileri araştırılmaya başlanmıştır. Bu transkripsiyon faktörlerinin ifadesi, glial hücrelerin oluşumu ve gliomaların gelişimini düzenlemek için gereklidir. NFIA ve NFIB özellikle glia öncül hücrelerinin proliferasyonu ve farklılaşmasını etkilemekte, bu transkripsiyon faktörlerinin düzensiz ekspresyonu, tümör oluşumuna katkıda bulunmaktadır. NFI proteinleri glioma hücrelerinin, farklılaşma ile ilişkili GFAP ifadesini tetiklemekte, bu şekilde NFI proteinleri glia hücrelerin farklılaşmasını ve göçünü kontrol etmektedir. NFI transkripsiyon faktörlerinin aktivitesi, fosforilasyon gibi post-translasyonel modifikasyonlarla düzenlenir. Çeşitli çalışmalar, NFI'lerin fosforilasyon durumunun glioma progresyonundaki rolünü incelemiştir. Özellikle, NFIA ve NFIB'nin fosforilasyonu, glioma hücrelerinde migrasyon hızını düzenlemekte, hipofosforillenmiş NFI'ler migrasyonu artırırken, hiperfosforillenmiş formlar migrasyonu yavaşlatmaktadır. NFI fosforilasyonundaki bu farklılık, glioblastomanın metastatik potansiyeliyle bağlantılı olabilir çünkü migrasyondaki artış, tümörün yayılmasında kritik bir faktördür. Ayrıca, NFI'lerin fosforilasyon örüntüsü, hücre döngüsü düzenleyicileri, apoptoz ve farklılaşma ile ilintili genlerin ekspresyonunu değiştirebilir. Özellikle, NFIA ve NFIB, glioblastoma hücrelerinin farklılaşarak astrositik formlara dönüşmesini teşvik ederek, hücre proliferasyonunu yavaşlatabilmekte ve böylece tümörün malignitesini azaltabilmektedir. Ancak, NFI aktivitesinin kaybı veya fosforilasyonlarının bozulması, hücre proliferasyonuna ve tümörlerin daha agresif hale gelmesine neden olabilir. Glioblastomada, NFIB'nin tümör büyümesini indükleyici rolü, Nfib ifadesinin silinmesinin hayvan modellerinde tümör hacmini ve metastazı azalttığını gösteren çalışmalarla desteklenmektedir. Glioblastomada yüksek NFIB ifade düzeyleri, hücresel migrasyonu ve invazyonu artırmakta, tümör agresifliği ve kötü prognoz ile ilişkilendirilmektedir. Ancak NFIB glia hücre farklılaşmasını tetikleyerek, maligniteyi de azaltabilir. Yapılan çalışmalar, NFIB'nin tümör progresyonunda yer alan birkaç sinyal yolunu düzenlediğini göstermiştir, bunlar arasında PI3K/AKT ve MAPK yolakları yer alır. Bu yolaklar, hücre proliferasyonu, hayatta kalma ve migrasyonu kontrolünde kritik öneme sahiptir ve NFIB'nin bu yolakları aktive etmesi, gliomaların habis fenotipine neden olabilir. Yukarıda belirtildiği gibi, fosforilasyon, NFI aktivitesini düzenler; fosforilenmemiş NFI en aktif form iken, hiperfosforillenmiş NFI en az aktif formdur. Ancak, NFI fosforilasyonunun altında yatan moleküler mekanizmalar hala belirsizdir, bu nedenle ilgili kinazlar ve fosfatazların daha fazla araştırılması gereklidir. Bu çalışmada, malign glioma (MG) hücre hatlarında, NFI'ların transkripsiyonel aktivitesini düzenleyen post-translasyonel mekanizmalardan biri olan fosforilasyonu incelemeyi amaçladık. NFIB protein üzerindeki fosforilasyon motiflerini ve bu motifleri tanıyan potansiyel kinazları saptamak için hiper- ve hipofosforillenmiş NFI ifade eden MG hücre hatlarını model sistem olarak seçtik. Bu amaçla, MG hücreleri HA-NFIB kodlayan virüsler ile enfekte edildi ve NFIB, immünopresipitasyon yoluyla izole edildi. Ardından, izole edilen proteinler, çeşitli fosforile S/T kinaz substrat motiflerini tanıyan antikorlar kullanılarak immünoblotlamaya tabi tutuldu. NFIB fosfo-motiflerinin AKT, PKC, ATM/ATR ve CDK tarafından tanındığı ve potansiyel olarak bu kinazlar tarafından fosforile edilebileceğini gösterdik. Ayrıca, NFI'lerin fosforilasyonunu etkileyebilecek yukarı yöndeki sinyal yollarını incelemek için spesifik inhibitörler kullanıldı ve MG hücrelerinde NFIB mobilite değişikliklerini araştırıldı. Ön veriler AKT yolağının durdurulmasının NFI fosforilasyonunu artırdığını, mTOR, WNT ve SHH yolaklarının bloklanmasının ise NFI fosforilasyonunu azalttığını göstermektedir.
Özet (Çeviri)
Gliomas constitute the largest group of CNS tumors, and are classified into various subsets based on WHO grades, with glioblastoma (GBM) representing most aggressive grade IV tumor. GBM can be primary or secondary, with primary GBMs typically occurring in older individuals and secondary GBMs arising from lower-grade astrocytomas in younger patients. Genetic alterations, including EGFR amplification, PTEN mutations, and IDH1 mutations, play a significant role in GBM tumorigenesis, particularly through the EGFR/PTEN/Akt/mTOR pathway. Proneural subtype of GBM is associated with an improved prognosis, whereas classic and mesenchymal subtypes are associated with poor outcomes. Although treatment options have improved, the median survival rate for GBM patients remains restricted to 12–15 months. Nuclear factor I (NFI), initially isolated from HeLa cell nuclear extracts, is crucial for adenovirus DNA replication and binds to its replication origin. The NFI family consists of NFIA, NFIB, NFIC, and NFIX—with alternative splicing producing multiple isoforms. NFIs consist of DNA binding and dimerization domain at the N terminal and transcription activation/repression domain at the C terminal. Phosphorylation plays a critical role in modulating NFI activity, with studies showing that NFI phosphorylation status affects its transcriptional activity, especially in glioblastoma cell lines. Recent research indicates a feedback loop where Calpain regulates NFI phosphorylation, influencing gene expression and cellular effects, which highlights the need for further investigation into the kinases and phosphatases involved. NFIs are essential for the development of neuronal and glial cells, directly regulating genes like NF-M, GFAP, and MBP. NFI knockout mice exhibit significant developmental defects, particularly in the brain, including hydrocephalus and forebrain abnormalities, and in some cases, lethality. NFIs also play key roles in neural differentiation and specifically, gliogenesis; as NFIA and NFIB are essential for glia formation in the forebrain and induce glial markers such as GFAP. The involvement of Nfib in processes such as glial maturation and adipocytogenesis indicates its broad physiological impact. NFIs are highly enriched at enhancers in quiescent NSCs in vitro. In the adult, NFIX is also required for stem cell survival and maintenance. Elsewhere, in the hair follicle niche, stem cells are subject to regulation by NFIB, as it modulates cellular processes such as cell proliferation, survival, and differentiation. NFIB interacts with chromatin modifiers, like EZH2, and promotes chromatin accessibility, which can facilitate metastasis in cancer. NFIB exhibits dual roles in cancer: as an oncogene in small cell lung carcinoma and triple-negative breast cancer, while also functioning as a tumor suppressor in lung adenocarcinoma and cutaneous squamous cell carcinoma. In glioblastoma, NFIB expression is linked to tumor progression, yet it may also mitigate malignancy by promoting glial differentiation. As previously reported, phosphorylation regulates NFI activity, with dephosphorylated NFI being the most active form and hyperphosphorylated NFI being the least active. However, the molecular mechanisms underlying NFI phosphorylation remain unclear, necessitating further research to identify the kinases and phosphatases involved in this process. In the present study, we set out to find out more about one of the post-translational mechanisms regulating NFIB: phosphorylation. We aimed to explore phosphorylation motifs and potential kinases phosphorylating NFIB, selecting MG cell lines with hyper- and hypo-phosphorylated NFIs as a model system. For this reason, MG cells were transduced with HA-NFIB coding virus, and NFIB was isolated by immunoprecipitation. Subsequently, the isolated proteins were immunoblotted using antibodies that recognize phosphorylation motifs of several S/T kinases. We found that NFIB is potentially phosphorylated by AKT, PKC, ATM/ATR and CDK. Next, to examine upstream signaling pathways that could affect phosphorylation of NFIs, specific inhibitors were employed and to investigate mobility shifts in MG cells. Preliminary data indicates that inhibiting AKT leads to increased phosphorylation of NFIs while inhibiting mTOR, SHH and WNT leads to decreased phosphorylation of NFIs in U87 MG cells.
Benzer Tezler
- Exploring molecular mechanisms that underlie regulation of transcription factor NFIB by the peptidyl prolyl isomerase pin1
NFIB transkripsiyon faktörünün peptidil prolil isomeraz PIN1 tarafından regülasyonunun moleküler mekanizmalarının araştırılması
SİNEM SARITAŞ ERDOĞAN
Doktora
İngilizce
2025
Biyokimyaİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR
- Investigation of NFIB binding to CDO and FGF19 gene regulatory regions by chromatin immunoprecipitation
NFIB'nin CDO ve FGF19 gen düzenleyici bölgelerine bağlanmasının kromatin immün çöktürme yöntemiyle araştırılması
CEMRE LEKTEMUR
Yüksek Lisans
İngilizce
2017
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR
- Investigating molecular interaction networks of nuclear factor one transcription factors
Nükleer faktör I transkripsyon faktörlerinin moleküler etkileşim ağlarının araştırılması
DİCLE MALAYMAR PİNAR
Doktora
İngilizce
2024
Biyokimyaİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR
DOÇ. DR. MARKKU VARJOSALO
- Investigation of the interaction between NFI and its potential interaction partner BRG1
NFI proteininin potansiyel etkileşim partneri olan BRG1 ile etkileşiminin araştırılması
SELİM TÜRKEL
Yüksek Lisans
İngilizce
2018
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR
- Ortaöğretim öğretmenlerinin teknolojik pedagojik alan bilgisi düzeylerinin etkileşimli tahta ve diğer öğretim teknolojilerini kullanma durumlarına göre incelenmesi
Exploring the technological pedagogical content knowledge level of high school teachers with respect to use of interactive whiteboards and other instructional technologies
SİNAN BİLİCİ
Yüksek Lisans
Türkçe
2015
Eğitim ve ÖğretimYüzüncü Yıl ÜniversitesiBilgisayar ve Öğretim Teknolojileri Eğitimi Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ÇETİN GÜLER