Geri Dön

Investigation of il-27 secreting regulatory B cells(i27breg) and i27breg derived exosomes

Il-27 üreten regülatör B hücreleri (ı27breg) veı27breglerden elde edilmiş eksozomların araştırılması

PDF İndir

  1. Tez No: 962437
  2. Yazar: SUDENUR ARSOY
  3. Danışmanlar: PROF. DR. AYÇA SAYI YAZGAN
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Allerji ve İmmünoloji, Allergy and Immunology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2025
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 113

Özet

B hücreleri, antikor üretme ve T lenfositlerine antijen sunma yetenekleriyle adaptif bağışıklığın anahtar oyuncularından biridir. Ayrıca, aynı patojenle tekrar karşılaşıldığında organizmayı koruyan ve bağışıklık tepkisine katkıda bulunan hafıza hücrelerine dönüşebilirler. B hücreleri iki ana gruba ayrılır: B1 ve B2 hücreleri. B1 hücreleri dokuda yerleşik hücrelerdir, doğuştan gelen özelliklere sahiptirler, kendilerini yenileyebilirler ve antijene spesifik olmayan doğal IgM antikorları üretebilirler. B1 hücreleri yumurta sarısı ve fetal karaciğerde oluşurlar, yenidoğan döneminden kısa bir süre sonra, ana yerleşim bölgeleri olan plevral ve peritoneal boşluklara göç ederler. B1 hücreleri, B-1a ve B-1b alt gruplarına olgunlaşır ve bunlar, B-1a alt grubunda CD5'in spesifik yüzey markörü ekspresyonu ile ayırt edilir. B2 hücreleri, antijenleri sunabilen ve antikor üretebilen“geleneksel”B hücreleri olarak bilinir.İmmünolojik tolerans, bağışıklık sisteminin önemli bir mekanizmasıdır. Organizmayı kendi bağışıklık sisteminden korur ve aşırı bağışıklık tepkilerinin oluşmasını önler. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, bağışıklık baskılayıcı özelliklere sahip yeni bir B hücresi alt popülasyonunun varlığını ortaya çıkarmıştır. Bhan ve meslektaşları, bu B hücresi alt popülasyonunu düzenleyici B hücreleri (Breg) olarak tanımlamıştır. Breg'ler, Interleukin-10 (IL-10) üreten CD1dhiCD5+ B10 hücreleri, CD19+CD21hiCD23hiCD24hi geçiş 2 marjinal bölge öncü hücreleri (T2-MZP), CD19+CD5+ B-1a hücreleri, CD138+ plazma B hücreleri gibi yüzey belirteçlerinin ifadesine göre alt gruplara ayrılmıştır. Breg'ler, IL-10, TGF- ve IL-35 gibi anti-enflamatuar sitokinleri salgılayarak bağışıklık baskılayıcı işlevlerini yerine getirirler. Ek olarak, işlevselliğini korumak için programlanmış ölüm ligandı 1 (PD-L1), CD73, CD39 gibi membranla ilişkili molekülleri de kullanabilirler. Farklı uyarılar üzerine Bregs farklılaşması tetiklenir. H.felis tam antijeni ile uyarılan B hücrelerinin, TLR2 ve MyD88 sinyalleşmesi yoluyla IL-10 salgılayan Breg farklılaşmasını tetiklediği gösterilmiştir. Benzer şekilde, TLR9 ligandı CpG(K3) de B hücresinin IL-10 salgılayan plazma blastlarına farklılaşmasını indükler.IL-27, p28 ve EBI-3 alt birimlerinden oluşan heterodimerik bir sitokindir. IL-6/IL-12 ailesine aittir. IL-27, Th1 farklılaşmasını ve IFN- üretimini indükleyerek proinflamatuar olarak işlev görebilir. IL-27, Th17 hücrelerinin farklılaşmasını inhibe ederek T hücre yanıtlarını modüle ederek anti-inflamatuar sitokin olarak da işlev görebilir ve böylece Th1 ve Th17 hücre yanıtları arasındaki dengeyi değiştirebilir. IL-27, hücresel bağlam ve uyaranlara bağlı olarak değişen çift işlevli bir sitokindir. Bu nedenle, tedavide kullanılmak üzere büyük bir potansiyel kazanmıştır. IL-27, merkezi sinir sisteminin kronik bir otoimmün hastalığı olan ve miyelin kılıfının bozulmasıyla karakterize edilen multipl skleroz (MS) dahil olmak üzere farklı otoimmün hastalık türlerinde araştırılmıştır. Choi ve arkadaşları tarafından yapılan yakın tarihli bir çalışmada, IL-27 salgılayan periton boşluğu (PeC) kaynaklı B-1a hücreleri keşfedilmiş ve i27Bregs olarak adlandırılmıştır. Bu hücreler hastalığa veya antijene özgü değildir. Verileri, LPS ve BCR ko-stimülasyonu (CD40/IgM) ile uyarılmanın IL-27 üretimini artırdığını göstermiştir. Ayrıca, bu i27Breg'lerin PD-1 ve Lag3'ü yukarı doğru düzenleyerek ve IL-35 ve IL-10 salgılayan düzenleyici B hücrelerinin farklılaşmasını teşvik ederek üveit ve ensefalomiyeliti hafifletdiği bulunmuştur, bu da çeşitli otoimmün CNS bozukluklarında potansiyel terapötik kullanımını düşündürmektedir.Ekzozomlar, tüm canlı hücreler tarafından salgılanan bir tür hücre dışı veziküldür. Proteinleri, metabolitleri ve nükleik asitleri taşıyabilirler. Küçük boyutları nedeniyle, çeşitli hastalıkların tedavisinde büyük terapötik potansiyele sahiptirler. i27Breg kaynaklı ekzozomların üveit semptomlarını hafifletdiği ve diğer merkezi sinir sistemi bozukluklarının tedavisinde kullanılabileceği gösterilmiştir. İmmün hücrelerin aktivasyonu için metabolik sinyallere ve ATP'ye bağlı olması nedeniyle, immünometabolizma giderek daha önemli bir araştırma alanı haline gelmiştir. Mitokondriyal metabolizma, immün hücre fonksiyonları için önemli olan temel enerji üretim mekanizmasıdır. B hücresi reseptörü (BCR) ve Toll benzeri reseptör (TLR) ile aktive edilen B hücrelerinin mitokondriyal dinamiklerini değiştirdiği gösterilmiştir. Çalışmamızın temel amacı, farklı TLR uyarımı üzerine IL-27 salgılayan düzenleyici B hücrelerini araştırmak ve bu hücrelerden salgılanan ekzozomları karakterize etmektir. Hedefimize ulaşmak için, VertX IL10egfp, IL-10 GFP raportör farelerden PeC hücrelerini izole ettik ve dalakları topladık. PeC hücreleri, LPS (5 µg/ml), H.felis (10 µg/ml), CpG(K3) (10 µg/ml) ve PAM3CSK4 (2,5 µg/ml) ile 72 saat boyunca kültürlendi. Dalağ Hücreleri, LPS (5µg/ml), H.felis (10µg/ml) ve CpG(K3) (10µg/ml) ile 72 saat boyunca kültürlendi. Ardından, hücreler toplandı ve B hücrelerini tespit etmek için CD19 ile boyandı ve akış sitometrisi ile IL-27p28 üretimini değerlendirmek için hücre içi IL-27p28 boyama yapıldı. Ayrıca, LPS, H.felis ve CpG(K3) ile uyarılmış PeC hücreleri ve splenositlerden proteinler ekstrakte edilerek western blot ile IL-27p28 protein ekspresyonu değerlendirildi. Ek olarak, uyarılmamış ve CpG(K3) ile uyarılmış PeC hücrelerinden eksosomlar ultra santrifüj ile izole edildi. Sonuçlarımız, PeC B hücrelerinde IL-27p28 üretim seviyelerinin, H.felis, PAM3CSK4 ve CpG(K3) ile uyarılmasının ardından, uyarılmamış kontrol grubuna kıyasla önemli ölçüde arttığını göstermiştir. İlginç bir şekilde, LPS uyarımı önceki literatürle çelişen önemli bir değişiklik yaratmamıştır. Western blot analizi, H. felis ve CpG (K3) ile uyarılan toplam PeC hücrelerinde IL-27p28 ekspresyonunun arttığını doğrularken, LPS ile uyarılan hücrelerde kontrol grubuna kıyasla saptanabilir protein seviyeleri görülmedi. Dalak B hücrelerinde, akış sitometrisi ile gösterildiği gibi, IL-27p28 üretim seviyeleri, uyarılmamış kontrol grubuna kıyasla tüm uyarılmış gruplarda önemli ölçüde artmıştı. Buna paralel olarak, western blot analizi, uyarılmamış kontrollere kıyasla tüm uyarılmış splenosit gruplarında IL-27p28 ekspresyonunda artış olduğunu ortaya koydu. Ayrıca, LPS, H.felis, CpG(K3) ve PAM3CSK4 ile uyarılma, PeC B hücreleri içinde IL-27p28+IL-10+ hücrelerin yüzdesinde önemli bir artışa yol açtı. Benzer şekilde, LPS, H.felis ve CpG (K3) ile uyarılan B hücreleri de IL-27p28⁺IL-10⁺ hücrelerin oranında önemli bir artış gösterdi, bu da IL-10 üreten PeC ve dalak B hücrelerinin önemli bir kısmının aynı anda IL-27p28 ürettiğini düşündürmektedir. Ek olarak, uyarılmamış ve CpG (K3) ile uyarılmış PeC hücrelerinden ekzozomları başarıyla izole ettik ve karakterize etmeye başladık.Daha önce, grubumuz H.felis LPS ve PAM3CSK4'ün dalak B hücrelerini uyarmasının, bu hücrelerin mitokondriyal membran potansiyelini (MMP) ve IL-10 üretimini artırdığını göstermiştir. Ancak, PeC kaynaklı B hücreleri için, LPS'nin IL-10 salgılanmasını indüklediği bildirilmiş olsa da, diğer TLR ligandlarının MMP ve IL-10 üretimi üzerindeki etkileri henüz araştırılmamıştır. İkinci amacımız, PeC kaynaklı B ve B1 hücrelerinde MMP ve IL-10 düzeylerini araştırmaktır. Bunu yapmak için, VertX IL10egfp, IL-10 GFP raportör farelerinden toplam PeC hücreleri izole edildi ve 72 saat boyunca H.felis (10µg/ml), LPS (5µg/ml) ve PAM3CSK4 (2,5µg/ml) ile uyarıldı. Daha sonra, hücreler B1 hücrelerini (CD19+CD23-) tanımlamak için B hücresi markörü CD19 ve CD23 ile boyandı ve MMP, akış sitometrisi ile Mitoview633 tarafından değerlendirildi. Sonuçlarımız, H. felis, LPS ve PAM3CSK4 uyarımı üzerine PeC B ve B1 hücrelerinde IL-10 üretiminin önemli ölçüde arttığını göstermiştir. MMP düzeyleri, üç uyarıcıyla da B1 hücrelerinde önemli ölçüde yükselirken, PeC B hücrelerinde MMP sadece H. felis uyarımı sonrasında önemli ölçüde artmıştır; LPS ve PAM3CSK4 önemli değişikliklere neden olmamıştır. Ek olarak, tüm uyarılmış gruplarda Mitoview633+IL-10+ hücrelerin oranı önemli ölçüde artmıştır, bu da baskılayıcı işlevler kazanan hücrelerin işlevsel mitokondriye sahip olduğunu göstermektedir. Özetle, bu çalışma, periton boşluğundan türetilen B hücreleri ve B-1a hücreleri ile dalak B hücrelerinin IL-27p28 salgılamasının çeşitli TLR uyarımları üzerine önemli ölçüde arttığını göstermektedir. Ayrıca, PeC hücrelerinden IL-27p28 içeren ekzozomları başarıyla izole ettik ve karakterize ettik. Dahası, PeC hücrelerinden LPS, PAM3CSK4, CpG (K3) ve H. felis uyarımı sonrasında IL-27 protein düzeyleri artmış ve PeC B ve B1 hücreleri tarafından IL-10 üretimi mitokondriyal metabolizma ile bağlantılı görünmektedir.

Özet (Çeviri)

B cells are one of the key players of adaptive immunity with their ability to produce antibodies and antigen presentation to T lymphocytes. They can also differentiate into memory cells which protect the organism from the re-encounter of the same pathogen contributing to the immune response. B cells are divided into two major groups: B1 and B2 cells. B1 cells are tissue-resident cells, they possess innate-like features, they can self-renew and produce natural IgM antibodies which are secreted non-specifically to the antigen. B1 cells are originated in yolk salk and fetal liver, after a short amount of time from neonatal phase, they migrate towards the pleural and peritoneal cavities, their major residing region. B1 cells are maturated into B-1a and B-1b subsets, which are discriminated by the specific surface marker expression of CD5 on B-1a subset. B2 cells have been known as the 'conventional' B cells which are able to present antigens and generate antibodies.Immunological tolerance is an important mechanism of the immune system. It protects the organism from its own immune system and prevent the formation excessive immune responses. Recent studies have enlightened the presence of a new B cell subpopulation which possess immune suppressive characteristics. Bhan and colleagues have identified this subpopulation of B cells as regulatory B cells (Breg). Bregs have been divided into subgroups based on their surface marker expressions such as Interleukin-10 (IL-10) producing CD1dhiCD5+ B10 cells, CD19+CD21hiCD23hiCD24hi transitional 2 marginal-zone precursor cells (T2-MZP), CD19+CD5+ B-1a cells, CD138+ plasma B cells have been defined in murine models. Bregs exert their immune suppressive functions by secreting anti-inflammatory cytokines such as IL-10, TGF- and IL-35. Additionally, they can also utilize membrane associated molecules like programmed death-ligand 1 (PD-L1), CD73, CD39 to maintain functionality. Upon different stimuli, Bregs differentiation is triggered. It was shown that B cells stimulated with H.felis whole antigen triggers the IL-10 secreting Breg differentiation through TLR2 and MyD88 signaling. Similarly, TLR9 ligand CpG(K3) also induce the B cell differentiation into IL-10 secreting plasma blasts.IL-27 is a heterodimeric cytokine which is composed of p28 and EBI-3 subunits. It belongs to the IL-6/IL-12 family. IL-27 can act as a pro-inflammatory by inducing Th1 differentiation and IFN- production. IL-27 can also act as an anti-inflammatory cytokine by modulating T cell responses modulation as it can inhibit the differentiation of Th17 cells, thereby altering the balance between Th1 and Th17 cell responses. IL-27 is a dual functioning cytokine that vary depending on the cellular context and stimuli. Therefore, it gained a great potential to be used in therapy. IL-27 has been investigated in different types of autoimmune diseases including Multiple Sclerosis (MS) which is a chronic autoimmune disorder of the central nervous system, characterized with the disrupted myelin sheath. In a recent study by Choi et al., IL-27 secreting peritoneal cavity (PeC) derived B-1a cells have been discovered and named as i27Bregs. These cells are not disease or antigen specific. Their data showed that stimulation with LPS and BCR co-stimulation (CD40/IgM) increased IL-27 production. Furthermore, these i27Bregs were found to alleviate uveitis and encephalomyelitis by upregulating PD-1 and Lag3 and promoting the differentiation of regulatory B cells that secrete IL-35 and IL-10, suggesting potential therapeutic use in various autoimmune CNS disorders.Exosomes are type of extracellular vesicles secreted by all living cells. They can carry proteins, metabolites and nucleic acids. Due to their small size, they hold great therapeutic potential for treating various diseases. It was shown that, i27Breg derived exosomes ameliorate the symptoms of Uveitis and can be used in treating other central nervous system disorders. Immunometabolism has become an increasingly important area of study, as immune cells rely on metabolic signals and ATP for activation. Mitochondrial metabolism is the key energy producing mechanism which is important for immune cell functions. It was shown that, B cells activated with B cell receptor (BCR) and Toll-like receptor (TLR) have altered mitochondrial dynamics. The primary aim of our study is to investigate the IL-27 secreting regulatory B cells upon different TLR stimulation and characterize exosomes secreted from these cells. To achieve our goal, we have isolated PeC cells and collected spleens from VertX IL10egfp, IL-10 GFP reporter mice. PeC cells were cultured with LPS (5µg/ml), H.felis (10µg/ml), CpG(K3) (10µg/ml) and PAM3CSK4 (2.5µg/ml) for 72 hours. Splenocytes were cultured with LPS (5µg/ml), H.felis (10µg/ml) and CpG(K3) (10µg/ml) for 72 hours. Then, cells were collected and stained with CD19 to detect B cells and intracellular IL-27p28 staining was performed to assess IL-27p28 production by flow cytometry. Moreover, proteins were extracted from LPS, H.felis and CpG(K3) stimulated PeC cells and splenocytes to evaluate IL-27p28 protein expression by western blot. In addition, exosomes from unstimulated and CpG(K3) stimulated PeC cells were isolated by ultracentrifugation. Our results demonstrated that, IL-27p28 production levels in PeC B cells were significantly increased following stimulation with H.felis, PAM3CSK4 and CpG(K3) compared to unstimulated control. Interestingly, LPS stimulation did not induce a significant change which contrasts with previous literature. Western blot analysis confirmed increased IL-27p28 expression in total PeC cells stimulated with H. felis and CpG (K3), while LPS-stimulated cells showed no detectable protein levels compared to controls. In the splenic B cells, IL-27p28 production levels were significantly increased in all stimulated groups compared to unstimulated control, as shown by flow cytometry. Consistently, western blot analysis revealed increased IL-27p28 expression in all stimulated splenocyte groups compared to unstimulated controls. Furthermore, stimulation with LPS, H.felis, CpG(K3) and PAM3CSK4 led to a significant increase in the percentage of IL-27p28+IL-10+ cells within PeC B cells. Similarly, B cells stimulated with LPS, H. felis, and CpG (K3) also showed a significant rise in the proportion of IL-27p28⁺IL-10⁺ cells, suggesting that a substantial fraction of IL-10-producing PeC and splenic B cells concurrently produce IL-27p28. Additionally, we also succesfully isolated and start to characterize exosomes from both unstimulated and CpG (K3) stimulated PeC cells.Previously, our group demonstrated that H.felis LPS and PAM3CSK4 stimulation of splenic B cells increased their mitochondrial membrane potential (MMP) and IL-10 production. However, for PeC derived B cells, while LPS-induced IL-10 secretion had been reported, the effects of other TLR ligands on MMP and IL-10 production remained unexplored. Our second aim is to investigate MMP and IL-10 levels in PeC derived B and B1 cells. To do this, total PeC cells were isolated from VertX IL10egfp, IL-10 GFP reporter mice and stimulated with H.felis (10µg/ml), LPS (5µg/ml) and PAM3CSK4 (2.5µg/ml) for 72 hours. Afterward, cells were stained for the B cell marker CD19 and CD23 to identify B1 cells (CD19+CD23-), and MMP was assessed by Mitoview633 via flow cytometry. Our results have demonstrated that, IL-10 production were significantly increased in both PeC B and B1 cells upon H.felis, LPS and PAM3CSK4 stimulationMMP levels were significantly elevated in B1 cells with all three stimuli, while in PeC B cells, MMP increased significantly only following H. felis stimulation; LPS and PAM3CSK4 did not induce significant changes. In addition, in all stimulated groups the proportion of Mitoview633+IL-10+ cells have significantly increased, suggesting that cells acquiring suppressive functions possess functional mitochondria. In summary, this study demonstrates that, IL-27p28 secretion of peritoneal cavity derived B cells and B-1a cells and splenic B cells is significantly enhanced upon various TLR stimulations. We also successfully isolated and characterized IL-27p28-containing exosomes from PeC cells Moreover, IL-27 protein levels from PeC cells increased after LPS, PAM3CSK4, CpG (K3), and H. felis stimulation, and IL-10 production by PeC B and B1 cells appears to be linked to mitochondrial metabolism.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    225385

    Caco-2 epitel hücresi ve THP-1 makrofaj hücrelerinin Streptococcus pyogenes ve Escherichia coli’ye karşı bakterisidal etki, nitrik oksit ve sitokin yanıtlarının araştırılması

    Investigation of bactericidal effect, nitric oxide and cytokine responses of Caco-2 epithelial cells and THP-1 macrophage cells against Streptococcus pyogenes and Escherichia coli

    DERYA BİRİKEN SALIN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2007

    MikrobiyolojiAnkara Üniversitesi

    Farmasötik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF.DR. SULHİYE YILDIZ

  2. Tez No

    306342

    Sıçan modelinde yorucu egzersizin karaciğer rejenerasyonuna etkisi

    Effect of exhaustive exercise on liver regeneration in rat model

    ELVAN ONUR KIRIMKER

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2011

    Genel CerrahiAnkara Üniversitesi

    Genel Cerrahi Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. KAAN KARAYALÇIN

  3. Tez No

    447251

    Aktif ve inaktif oküler behçet hastalarında serum IL-4, IL-12, IL-13, IL-27 ve IL-33 düzeylerinin araştırılması

    Investigation of serum IL-4, IL-12, IL,13, IL-27 and IL-33 levels in active and inactive ocular behçet's disease

    ABDULLAH KÜRŞAT CİNGÜ

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2016

    Allerji ve İmmünolojiDicle Üniversitesi

    İç Hastalıklar (İmmünoloji) Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MEHMET ORHAN AYYILDIZ

  4. Tez No

    631817

    Febril konvülziyon geçiren hastalarda IL 2, IL 6 ve IL10 sitokin genlerinin yeni nesil dizi analizi ile araştırılması

    Investigation of IL 2, IL 6 and IL 10 cytokine genes in patients with febrile convulsions by next generation sequence analysis

    FATİH KAYA

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2020

    Çocuk Sağlığı ve HastalıklarıDüzce Üniversitesi

    Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ ÖNDER KILIÇASLAN

  5. Tez No

    607066

    Kistik ekinokokkoz ve fasiyoliyaz'da IL-4, IL-10, TNF-α ve INF-γ düzeylerinin araştırılması

    Investigation of IL-4, IL-10, TNF-α and IFN-γ levels in cystic echinococcosis and fascioliosis

    CÜNEYT ALBAYRAK

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    ParazitolojiVan Yüzüncü Yıl Üniversitesi

    Parazitoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. YUNUS EMRE BEYHAN

Geri Dön