Geri Dön

LC-MS/MS-TQ yöntemi ile takviye edici gıdalarda jelatin kaynağının tür bazlı tanımlanması

The species-based identification of gelatin sources in dietary supplements using the LC-MS/MS-TQ method

PDF İndir

  1. Tez No: 964694
  2. Yazar: NAZAN BİNGÖL YILMAZ
  3. Danışmanlar: PROF. DR. OKTAY YEMİŞ
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Gıda Mühendisliği, Food Engineering
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2025
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Sakarya Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Gıda Mühendisliği Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 185

Özet

Jelatin, hayvanların bağ dokusundaki kolajenden termal, enzimatik, asidik veya bazik hidroliz yolu ile üretilen, açık sarı-beyaz renkte ve kokusuz nitelikte yüksek saflıkta ticari bir proteindir. Kolajen, başlıca domuz, sığır ve balık gibi hayvanların derisinde ve kemiklerinde bol miktarda bulunan bir bağ dokusudur. Jelatin, temelde kıvam artırıcı özelliği nedeniyle başta gıda endüstrisi (şekerlemeler, kremalar, tatlılar, takviye edici gıdalar, et ürünleri, soslar) olmak üzere kozmetik (kremler, losyonlar, yüz maskeleri) ve farmasötik ürünlerde (yumuşak jelatin kapsüller, sert jelatin kapsüller) çok yaygın kullanılan bir biyopolimerdir. Bu temel özelliğinin yanında jelatin, sahip olduğu benzersiz yapısal stabilitesi, kendine özgü işlevsel ve teknolojik özellikleri ve diğer fiziko-kimyasal özellikleri sayesinde jelleştirici, bağlayıcı, kaplayıcı, stabilize edici ve parlatıcı ajan olarak çok fonksiyonlu bir gıda bileşenidir. Günümüzde birçok üründe kullanılan bu bileşenin hangi kaynaktan elde edildiğinin doğru ve kesin bir şekilde ortaya konması başta dini hassasiyetler olmak üzere sağlık ve etik açıdan çok önemlidir. Müslümanlar ve Yahudiler, sahip oldukları inanç sisteminde dini kurallar gereği domuz ve domuz kaynaklı ürünleri tüketmezler. Bu nedenle, bir ürünün helal ya da koşer sertifikası alabilmesi için içerdiği jelatinin kaynağının belirlenmesi gereklidir. Ayrıca tüm dünyada vegan beslenme tercihlerinin artması ile hayvansal bir ürün olan jelatinin kaynağından bağımsız şekilde tüketimi tercih edilmemektedir. Bu bağlamda bir ürünün etiketi üzerinde jelatin kaynağının belirtilmesi, tüketicileri bilgilendirme ve yasal düzenlemelerin yerine getirilmesi açısından zorunludur. Ürün etiketinde görülecek şekilde jelatin kaynağının yazılması gerekir. Takviye edici gıdalar, karbonhidratlar, aminoasitler, mineraller, vitaminler, temel yağ asitleri, lif gibi besin öğelerini veya bunların dışında fizyolojik olarak etkileri bulunan biyoaktif maddeleri içeren yoğun besin kaynaklarıdır. Bu ürünler, belirli dozaj formlarında (haplar, tabletler, sert ve yumuşak kapsüller, sıvılar, tek kullanımlık toz şase) mevcut olup, normal diyeti desteklemek amacıyla kullanılır. Özellikle Covid-19 pandemisi ile beraber hem ülkemizde hem de tüm dünyada bu ürünlere olan çok ciddi boyutlara ulaşmıştır. Ağırlıklı olarak kapsül ve yumuşak şeker formunda bu ürünlerin üretiminde jelatin kullanılmaktadır. Farklı hayvansal kaynaklardan elde edilen jelatinlerden domuz jelatini, diğer hayvansal kaynaklı jelatinlere kıyasla hammaddenin daha yaygın ve ucuz olması nedeniyle piyasada çok daha ucuza satılmaktadır. Piyasada bulunan bazı takviye edici gıdalarda ve farmasötik ürünlerde kullanılan jelatinin kaynağına ilişkin yanlış veya eksik bilgilerle etiketlenmiş olabilir. Bu durum, içeriklerin durumu ve üretim sürecinin dini gereklilikleri karşılamaması nedeniyle, Yahudiler ve Müslümanlar için büyük bir sorun haline gelmiştir. Jelatin kaynağının tam bir kesinlikle belirlenmesi, farklı türlerdeki kolajenlerin amino asit dizilimlerindeki benzerlik nedeniyle özellikle zordur. Bugüne kadar jelatin orijinin belirlenmesine yönelik çeşitli çalışmalar yapılmıştır. Bu çalışmalarda PCR (polimeraz zincir reaksiyonu), ATR-FTIR (Attenuated Total Reflection- Fourier Transform Infrared), ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), 2D-SDS-PAGE (Two-dimensional Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) ve LC-MS/MS (Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry) analiz yöntemleri geliştirilmiştir. Bu yüksek lisans tezinde, bu teknikler içerisinde güvenirlik ve hassasiyet açısından en üst düzeyde olan LC-MS/MS-TQ (Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry-Triple Quadrupole) tekniği ile takviye edici gıdaların çeşitli formlarında jelatin tür tayinine yönelik bir metot geliştirme çalışması yapılmıştır. Üç temel aşamada gerçekleştirilen bu çalışmada, ilk aşamada LC-MS/MS için çalışma koşulları belirlenmiş ve belirlenen bu koşullarda oluşturulan metota ilişkin validasyon çalışmaları yapılmıştır. Domuz jelatinin tanımlanmasında, 1310 kütle ağırlığına sahip GETGPSGPAGPTGAR diziliminde ve 1465 kütle ağırlığına sahip SAGISVPGMGPSGPR diziliminde iki farklı belirteç peptit göz önünde bulundurulmuştur. Sığır jelatinin tanımlanmasında ise, 1559 kütle ağırlığına sahip GETGPAGPAGPIGPVGAR diziliminde ve 1192 kütle ağırlığına sahip IDQPGAVGPAGIR diziliminde iki farklı peptit indikatör olarak alınmıştır. Analizlerde sıvı kromatografi ile sıralı üçlü kuadrupole sahip bir kütle spektrometresi sistemi (LC-TQ, Liquid Chromatograpghy-Triple Quadrupole) kullanılmıştır. Söz konusu peptitler, 40°C'de termostatlı bir Poreshell 120 EC-C18 (4,6 x 100 mm) kolonunda ters fazlı sıvı kromatografisi ile ayrılmıştır. Mobil faz olarak sulu formik asit %0,1 (v/v) ve asetonitril içinde %0,1 (v/v) formik asit kullanıldığı 28,1 dakikalık bir gradient bir elüsyon programı uygulanmıştır. Bu sistemde akış hızı 0,6 mL/dak olup örnek enjeksiyon miktarı 2 µL olarak uygulanmıştır. Pozitif iyonizasyon modunda m/z 500-5000 kütle aralığında veriler elde edilmiştir. Optimize edilmiş MS parametreleri ise; pozitif iyon modunda ESI yöntemi kullanılmış olup, kurutma gazı sıcaklığı 300 oC, kurutma gazı akışı 11 L/dak, nebülizör basıncı 43 psi, sheath gazı sıcaklığı 330 oC, sheath gazı akışı 10 L/dak, kapiler voltaj 2600 V, nozzle voltaj ise 500 V. Validasyon çalışmalarında tespit limiti (LOD), hassasiyet, doğruluk, yanlış-pozitif, yanlış-negatif ve güvenirlik olmak üzere altı farklı parametre göz önünde bulundurulmuştur. Sığır ve domuz jelatin standartlarından farklı konsantrasyonlardan oluşan kalibrasyon eğrileri oluşturulmuş ve tespit limiti %0,012 olarak tespit edilmiştir. Ayrıca geliştirilen metotun hassasiyet, doğruluk ve güvenirliğinin %100 olduğu saptanmıştır. Çalışmanın ikinci aşamasında, piyasadan 8 adet yurtiçi ve 17 adet yurtdışı menşeili takviye edici gıda satın alınmıştır. Bu ürünlerin 10 adeti yumuşak kapsül, 12 adedi sert kapsül ve 3 adedi de yumuşak şeker formudadır. Kapsüller içeriklerinden arındırılarak homojenize edilmiş ve daha sonra tripsin enzimi 16 saat süre ile enzimatik parçalanma işlemine tabi tutulmuştur. Enzimatik parçalanma sonrası validasyonu yapılmış metot ile LC-TQ sisteminde analiz edilmiştir. Türkiye menşeili ürünlerde etiketlerinde sığır jelatini olduğu belirtilmesine rağmen bir tanesinde domuz jelatini tespit edilmiş, bir tanesinde ise her iki tür de tespit edilememiştir. Buna karşın, yurtdışı menşeili sekiz üründe etiketlerinde belirtilmemesine rağmen domuz jelatini tespit edilmiştir. Sonuçlar, söz konusu takviye edici gıdalarda jelatin tür tayininin düzenli olarak güvenilir metotlarla yapılmasının önemini ortaya koymuştur. Çalışmanın üçüncü aşamasında, metot validasyon çalışmalarındaki enzimatik parçalanma süresinin kısaltılmasına yönelik olarak ultrases destekli enzimatik parçalanma gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla numune 37°C'de etüvde 15-16 saat bekletilmek yerine, 15 dakika ultrasonik su banyosunda çözündürülmüş ve daha sonra enzim eklenerek 15 dakika daha ultrasonik su banyosunda enzimatik parçalanmaya bırakılmıştır. Bu şekilde 37°C'de 16 saatlik enzimatik parçalama işlemi sadece 30 dakika içinde tamamlanabileceği sonucuna ulaşılmıştır.

Özet (Çeviri)

Gelatin is a high-purity, light yellow-white color and odorless protein produced by thermal, enzymatic, acidic and basic hydrolysis from collagen in the connective tissue of animals. Collagen is a type of connective tissue that is found in significant amount in the skin and bones of animals such as cattle, pigs, and fish. Gelatin is a biopolymer widely used in the food industry (confectionery, creams, desserts, dietary supplements, meat products, sauces), cosmetics (creams, lotions, face masks), and pharmaceutical products (soft capsule shells, hard capcule shells), mainly for its thickening properties. In addition to this basic property, gelatin is a multifunctional food ingredient as a gelling, binding, coating, stabilizing, and glazing agent thanks to its unique structural stability, unique functional and technological properties, and other physicochemical properties. In the current cultural and sociological climate, it is imperative to accurately and precisely ascertain the provenance of this ingredient, which is utilised in numerous products, particularly from a religious, health and ethical standpoint. Muslims and Jews do not consume pork and pork- drived products due to religious rules in their belief systems. Therefore, in order for a product to be Halal or Kosher certified, it is necessary to identify the source of the gelatine it contains. In addition, with the increase in vegan dietary preferences around the world, gelatine, which is an animal product, is not preferred for consumption regardless of its source. In this context, it is mandatory to indicate the source of gelatine on the label of a product in order to comply with legal requirements and informing consumers. The orijin of jelatin must be written clearly on tte product of label. Dietary supplements are defined as concentrated sources of nutrients such as carbonhydrates, vitamins, minerals, amino acids, essential fatty acids, fibre or other bioactive substances with physiological effects. These products are available in a variety of dosage forms, including pills, tablets, hard and soft capsules,liquidsand disposable powder sachet, and are used to supplement a normal diet. The demand for these products has reached unprecedented levels in both Turkey and the rest of the world, particularly in the context of the ongoing pandemic. Gelatine is predominantly employed in the production of these products, specifically in the form of capsules and soft candies. Porcine gelatine is cheaper than other gelatins due to the greater avalibility and lower cost of its raw materials. Some dietary supplements and pharmaceutical products on the market may have inaccurate or incomplete labelling about the source of their gelatin. This has become a significant problem for both Jews and Muslims, as the status of the ingredients and the manufacturing process do not meet religious requirements. Identifying the origin of gelatine with absolute certainty is particularly difficult due to the similarity in the amino acid sequences of different types of collagen. To date, various studies have been conducted to determine the origin of gelatin.In this studies, PCR (Polymerase Chain Reaction), ATR-FTIR (Attenuated Total Reflection-Fourier Transform Infrared), ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), 2D-SDS-PAGE (Two-dimensional Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) and LC-MS/MS (Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry) analytical methods have been developed to determine the origin of gelatine. In this Master's thesis, a method development study was conducted for the determination of gelatine species in various forms of dietary supplements using the LC-MS/MS-TQ (Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry-Triple Quadrupole) technique, which is considered to be the most reliable and sensitive of these techniques. The present study was conducted in three primary stages. In the initial stage, the working conditions for LC-MS/MS were determined, and validation studies for the method developed under these conditions were carried out. In order to identify porcine gelatine, two marker peptides were considered: the sequence GETGPSGPAGPTGAR, with a mass weight of 1310, and the sequence SAGISVPGMGPSGPR, with a mass weight of 1465. In order to identify bovine gelatine, two different peptides were used as indicators. These peptides had the following sequences: GETGPAGPAGPAGPIGPVGAR (mass weight: 1559) and IDQPGAVGPAGIR (mass weight: 1192). The analyses were conducted using a mass spectrometry system incorporating liquid chromatography and sequential triple quadrupole (LC-TQ, liquid chromatography-triple quadrupole) technology. The separation of peptides was achieved through the utilisation of reversed-phase liquid chromatography, employing a thermostatically controlled Poreshell 120 EC-C18 column (4.6 x 100 mm) at a temperature of 40°C. A gradient elution programme was applied for 28.1 min using a mobile phase composed of water (0.1% v/v, formic acid) and acetonitrile (0.1% v/v, formic acid). In this system, the flow rate was 0.6 mL/min, and the sample injection volume was 2 µL. The data were obtained in the mass range m/z 500-5000 in positive ionisation mode. The following MS parameters were optimised: The ESI method was employed in positive ionisation mode, with the drying gas temperature set at 300°C, a drying gas flow of 12 L/min, a nebuliser pressure of 45 psi, a sheath gas temperature of 350°C, a sheath gas flow of 11 L/min, a capillary voltage of 3000 V, and a nozzle voltage of 500 V. Five distinct parameters, namely limit of detection (LOD), precision, accuracy, false-negative, false-positive and reliability, were considered in the validation studies. Calibration curves were generated using different concentrations of bovine and porcine gelatin standards, and the limit of detection was determined to be 0.012%. Furthermore, the developed method was found to be 100% precise, accurate, robust, and reliable. In the second phase of the study, 8 domestic and 17 imported dietary supplements were purchased from the market. Ten of these products were in soft capsule form, 12 in hard capsule form and 3 in soft candy form. The capsules were homogenised by removing the contents and then subjected to enzymatic digestion with trypsin enzyme for 16 hours. After enzymatic digestion, they were analysed in the LC-TQ system using a validated method. Porcine gelatine was detected in only one supplement despite the declaration of bovine gelatine used on the labels of supplements of Turkish origin. It was interesting that neither bovine nor porcine gelatine could be detected in one of these samples. Conversely, the presence of porcine gelatine was detected in eight supplements of imported origin, despite being undeclared on the labelling. The results showed the importance of regular determination of the type of gelatine in these food supplements by reliable methods. In the third stage of the study, ultrasonic assisted enzymatic digestion was carried out to reduce the enzymatic digestion process. Instead of keeping the sample in the oven at 37°C for 15-16 hours, this was done by dissolving the sample in an ultrasonic water bath at 37°C for 15 minutes, then adding the enzyme and allowing the sample to enzymatically digest in an ultrasonic water bath for a further 15 minutes. It was concluded that 16 hours of enzymatic digestion at 37°C could be completed in only 30 minutes.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    791447

    Nanomateryal bazlı mikro-katı faz ekstraksiyonu ile önderiştirme yapılmıģ çeşitli numunelerin HPLC-MS/MS analizleri ve biyosensör tasarımları

    HPLC MS / MS analyzes of various samples carried out with nanomaterial-based microsolid phase extraction and biosensors design

    TUTKU CEREN KARABULUT

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    KimyaAnkara Üniversitesi

    Eczacılık Temel Bilimleri Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. SİBEL AYŞIL ÖZKAN

  2. Tez No

    813284

    Aflatoksinle kontamine olmuş kuru incirlerin biyodegredasyon ile geri kazanımı

    RECOVERY OF AFLATOXIN-CONTAMINATED DRIED FIGS BY BIODEGRADATION

    SENEM ÖZTÜRK KÖSE

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    BiyoteknolojiAydın Adnan Menderes Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. HACI HALİL BIYIK

  3. Tez No

    142597

    Yeni Cami'nin akustik açıdan performans değerlendirmesi

    Evaluation of the acoustical performance of the New Mosque

    EVREN YILDIRIM

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2003

    Mimarlıkİstanbul Teknik Üniversitesi

    Mimarlık Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. SEVTAP YILMAZ DEMİRKALE

  4. Tez No

    929602

    Barsak enflamasyonu oluşturulan hücre kültür modelinde, timokinonun biyolojik aktiviteleri ile metabolomik profillemesinin araştırılması

    Investigation of the biological activities and metabolomic profiling of thymoquinone in an in vitro model of intestinal inflammation

    ÖZNUR YAŞAR

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    BiyokimyaBezm-i Alem Vakıf Üniversitesi

    Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ABDURRAHİM KOÇYİĞİT

  5. Tez No

    705145

    Ergene nehrinde pestisit kalıntılarının belirlenmesi

    Determination of pesticide residues in Ergene river

    MEVLANA KARAKAYA

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2021

    KimyaBursa Teknik Üniversitesi

    Çevre Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. AHMET AYGÜN

Geri Dön