Geri Dön

Production of recombinant bevacizumab antigen-binding fragment in Pichia pastoris

Pichia pastoris'te rekombinant bevacizumab antijen bağlayıcı fragman üretimi

PDF İndir

  1. Tez No: 974847
  2. Yazar: UMUT HASKÖK
  3. Danışmanlar: PROF. DR. ŞERİF ŞENTÜRK, PROF. DR. MEHMET İNAN
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Biyomühendislik, Genetik, Biotechnology, Bioengineering, Genetics
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2025
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Dokuz Eylül Üniversitesi
  10. Enstitü: İzmir Uluslararası Biyotıp ve Genom Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji ve Moleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

Bevacizumab, Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü(VEGF)'e spesifik olarak bağlanarak VEGF aracılı sinyal yollarını ve dolayısıyla anjiyogenezisi inhibe eden ve metastatik kolorektal kanser hastalarında sağ kalımı arttıran humanize bir immünoglobulin G monoklonal antikorudur. Antijen bağlayıcı parçası (Fab), tam uzunluktaki antikorlara kıyasla daha kısa bir yarı ömre sahiptir ve bağışıklık sistemini aktive etmekten sorumlu olan parça kristalize edilebilir (Fc) alanından yoksundur. Biyofarmasötik sektörü, özellikle Fab'lar ve scFv'ler (tek zincirli değişken parça) gibi uygun maliyetli, glikozile edilmemiş antikorlar geliştirmek amacıyla, monoklonal antikor üretimi için alternatif konaklar araştırmaktadır. Endüstriyel bir maya olan Komagataella phaffii(Pichia pastoris), hızlı çoğalması, yüksek protein verimi ve basit genetik manipülasyonu nedeniyle rekombinant monoklonal antikorların üretimi için ekonomik bir platform sağlar. K. phaffii'in AOX1, DAS2, GAP gibi birçok güçlü promotörü vardır. Bunun yanı sıra, ADH2 etanol tarafından indüklenen ve yüksek ekspresyon sorumlu dikkate değer bir promotördür. Bu çalışmada, Bevacizumab'ın ağır zincir Fab ve hafif zincir genleri, ADH2SNT5 (sentetik ADH2 promotörü) promotörünün kontrolü altında ekspresyon vektörüne ayrı ayrı ligasyon edildi ve K. phaffii MK115-PDI (laboratuvarda geliştirilen) suşuna transforme edildi. Ağır veya hafif zinciri ifade eden iki haploid suş, Fab üretimi yapabilen diploid K. phaffii hücreleri oluşturmak için eşleştirildi. Yüksek üretimli diploid bir K. phaffii klonu 96-deep well taraması sonucu seçildi ve koşulları (25°C, pH 5) erlenli flask üretiminde optimize edildi. Protein L kromatografisi ile ilk saflaştırmanın ardından biyoreaktör üretimi, 328,8 mg/L Fab elde edildi. Protein G kromatografisi, saflığı iyileştirerek 93,4 mg/L bozulmamış Fab elde etti. Yüzey plazmon rezonans analizi, Protein G ile saflaştırılmış Fab'da (6,59 nM), Protein L ile saflaştırılmış Fab'a (14,45 nM) kıyasla daha güçlü VEGF bağlanması gösterdi ve bu da yapısal bütünlüğün arttığını gösterdi. Genel olarak, Bevacizumab antijen bağlayıcı parçasının rekombinant üretimi, literatürde daha önce bildirilmemiş olan diploid K. phaffii suşları, PDI aşırı ekspresyonu ve ADH2SNT5 promotörünü içeren yeni bir yaklaşım kullanılarak gerçekleştirildi.

Özet (Çeviri)

Bevacizumab is a humanized immunoglobulin G monoclonal antibody that specifically binds to Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), inhibiting VEGF-mediated signalling pathways and consequently angiogenesis and improving survival in metastatic colorectal cancer. Antigen-binding fragments (Fabs) exhibit a shorter half-life compared to full-length antibodies and lack the fragment crystallizable (Fc) domain, which is responsible for activating the immune system. The biopharmaceutical sector is currently investigating alternate hosts for the manufacture of monoclonal antibodies, particularly to develop cost-efficient, non-glycosylated antibodies such as Fabs and scFvs. Komagataella phaffii(Pichia pastoris), an industrial yeast, provides an economical platform for the synthesis of recombinant monoclonal antibodies, attributed to its rapid proliferation, elevated protein yields, and straightforward genetic manipulation. There are many strong promoters of Komagataella phaffii , such as AOX1, DAS2, and GAP. Besides that, ADH2 is a remarkable promoter that is induced by ethanol with a high expression level. In this study, heavy chain Fab and light chain genes of Bevacizumab were individually ligated into an expression vector under the control of the ADH2SNT5(synthetic ADH2 promoter) promoter, which was transformed into the K. phaffii MK115-PDI in-house (overexpressed PDI) strain. Two haploid strains expressing either the heavy or light chain were mated to create diploid K. phaffii cells capable of Fab production. A high-producing diploid K. phaffii clone was identified and optimized for pH and temperature in shake flask experiments. The optimum pH and temperature were determined as pH 5 and 25°C, respectively. Bioreactor production followed by initial purification with Protein L chromatography yielded 328.8 mg/L of Fab; Protein G chromatography improved purity, yielding 93.4 mg/L of intact Fab. Surface plasmon resonance analysis showed stronger VEGF binding for the Protein G-purified Fab (6.59 nM) versus the Protein L-purified Fab (14.45 nM), indicating enhanced structural integrity. Overall, the recombinant production of Bevacizumab Fragment Antigen Binding (Fab) was achieved using a novel approach involving diploid K. phaffii strains overexpression of protein disulfide isomerase (PDI) and the ADH2SNT5 promoter, which has not been previously reported in the literature.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    58594

    Production of recombinant human BRCA1 encoded proteins in E.coli

    İnsan BRCA1 rekombinant proteinin E.coli'de üretilmesi

    BERNA SUAT ÖZÇELİK

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    1997

    Biyolojiİhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MEHMET ÖZTÜRK

  2. Tez No

    96193

    Production of recombinant human B-catenin protein in E. coli and screen ing for ants-B-catenin auto-antibodies in cancer sera

    E. COLİ'de rekombinant insan beta-katenin proteininin üretimi ve kanser serumlarında beta-katenin otoantikorlarının taranması

    NURİ ÖZTÜRK

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2000

    Biyolojiİhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MEHMET ÖZTÜRK

  3. Tez No

    510650

    Production of recombinant amylopullulanase enzyme from Thermoanaerobium brockii brockii

    Thermoanaerobium brockii brockii kaynaklı amilopullulanaz enziminin rekombinant üretimi

    HANDE MUMCU

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2018

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)

    PROF. DR. NEVİN GÜL-KARAGÜLER

  4. Tez No

    597097

    Production of recombinant human serum albumin in transgenic plants and plant cells

    Başlık çevirisi yok

    AYŞE MELTEM MAVİTUNA

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2005

    BiyolojiRheınısch-Westfalısche Technısche Hochschule Aachen

    PROF. DR. RAINER FISHER

  5. Tez No

    695041

    Production of recombinant antibody fragments in bacteria and their development towards medical diagnosis

    Rekombinant antikor fragmanlarının bakterilerde üretimi ve tıbbi tanıya yönelik geliştirilmesi

    İLKAY KOÇER KULOĞLU

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2021

    Kimya MühendisliğiHacettepe Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. EDA ÇELİK AKDUR

    PROF. DR. MATTHEW P. DELISA

Geri Dön