Geri Dön

Investigation of the functional effects of the msh2 a733t variant of uncertain significance identified in the turkish population

Türk popülasyonunda bulunan klinik önemi bilinmeyen msh2 a733t varyantının protein fonksiyonu üzerine etkilerinin araştırılması

PDF İndir

  1. Tez No: 979419
  2. Yazar: CEREN ÇİFTÇİ
  3. Danışmanlar: PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoloji, Biology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2025
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

Dünya genelinde kanser vaka sayıları giderek artmakta ve hem halk sağlığı hem de ülke ekonomileri üzerinde olumsuz sonuçlar doğurmaktadır. Hem ülkemiz hem de dünya genelinde kolorektal kanser hem insidans hem de mortalite açısından ilk sıralarda yer almakta olup vakaların yaklaşık %10'u kalıtsaldır. Lynch Sendromu ise kolorektal kanserin en büyük sebebi olarak bilinmektedir. Laboratuvarımızda yürüttüğümüz çalışmada popülasyonumuza özgü kansere yatkınlık genlerindeki mutasyon profilinin çıkarılması amaçlanmış ve 370 kolorektal kanser hastasının Lynch Sendromuna neden olan yanlış eşleşme onarım (MMR) genleri (MSH2, MSH6, MLH1 ve PMS2) de dahil olmak üzere kansere yatkınlık genleri yeni nesil dizileme teknolojisi kullanılarak çoklu gen panel testiyle araştırılmıştır. Elde edilen varyantlar Amerikan Tıbbi Genetik ve Genomik Koleji (ACMG) standartlarına göre yorumlanmıştır. Bu çalışma MSH2 gen uzunluğu düşünüldüğünde kolorektal kanser hastalarında MMR mekanizmasında rol oynayan genler arasında en fazla sayıda klinik önemi bilinmeyen varyant (VUS) tespit edilen genlerden biri olduğunu ortaya koymuştur. Bu tez çalışması kapsamında tespit edilen tekrarlı MSH2 A733T VUS'unun fonksiyonel analizler kullanılarak protein üzerine etkilerinin incelenmesi ve patojenisitesine ilişkin ek kanıtların elde edilmesi hedeflenmektedir. Yapılan çalışmalar hedef proteini çalışmanın zorluğunu ortaya koymuş ve kısıtlı literatür bilgisinin mevcudiyetine neden olmuştur. Bu çalışma kapsamında seçilen varyantın sahip olduğu mutasyonun protein fonksiyonu üzerine etkileri incelenerek bu varyantın yeniden sınıflandırılabilmesine yönelik kanıtlar toplanmış ve patojenisitesi araştırılmıştır. Bu doğrultuda hem yabanıl tip hem de varyasyonu içeren genler bakteriyel ve memeli ekspresyon vektörüne klonlanmıştır. Proteinlerin üretim ve saflaştırma süreçlerinin optimize edilmiştir. Saflaştırılan proteinler stabilite ve ikincil yapı analizi yapılarak karakteriz edilmiştir. Proteinlerin fonksiyonel analizlerini gerçekleştirmek üzere MSH2'den yoksun olduğu bilinen LoVo kolorektal kanser hücre hattı kullanılarak hMSH2 yabanıl tip ve mutant proteinlerin geçici transfeksiyon yoluyla aşırı ifadesi sağlanmıştır. MSH2 ve etkileşim partnerlerinin gen ve protein seviyesinde ifade değişimlerini araştırmak için kantitatif PCR ve hücre alt yolak protein analizleri, MSH2'nin hücre içi bağlanma partneri olan MSH6 ile heterodimerizasyonunu karşılaştırmak için bağlanma deneyleri gerçekleştirilmiştir. DNA hasarının onarılamadığı durumda MSH2 aracılığı ile hücre ölüm yolaklarının aktive edildiği bilindiğinden, varyantın hücre canlılığı üzerine etkisi analiz edilmiştir. Fonksiyonel analizler sonucunda seçilen varyantın yabanıl tip MSH2 ile karşılaştırıldığında hücre ölüm yolağı üzerinde bulunan proteinleri aktive etmede yetersiz kalarak hücreyi ölüme yönlendirmede başarısız olduğu görülmüştür. Mutant proteinin interaksiyon partneri ile ilişkisi gen ve protein düzeyinde çalışmalar ile aydınlatılarak yabanıl tip MSH2 ile karşılaştırıldığında partnerini stabil tutmada yeterli olamamıştır. Bu doğrultuda gerçekleştirilen bağlanma deneyleri de proteinin heterodimerizasyon yeteneğinde bir azalma ile elde edilen bulguları desteklenmiştir. Bu sonuçlar yapısal analizler ve moleküler dinamik çalışmaları ile beraber incelendiğinde artan protein stabilitesinin kompleks oluşumunu nasıl engellediğine dair hipotez ortaya konularak hücresel seviyede mutantın oluşturduğu yanıtın nedenleri araştırılmıştır. Bu bulgular alt sinyal yolaklarında sinyalin iletilememesi ile yansımış olup hücrede mutant protein varlığında kanserleşmeye neden olabilecek sonuçlar doğurmuştur. Bu sonuçlar varyantın kanserleşme üzerinde olumsuz etkisini göstermiş olup varyantın yeniden sınıflandırılması için destekleyici kanıt sunma potansiyeline sahip olduğu ortaya koyulmuştur. Hedef gen, DNA hasarını algılayıp onarmak için önemli bir proteini kodlamaktadır. Mutasyonlar protein-protein etkileşimlerini bozarak normal protein fonksiyonunu kaybetmesine neden olmaktadır. Bu bağlamda patojenik/muhtemel patojenik olduğu fonksiyonel analizlerle değerlendirilmiş olan VUS'lara özgü peptitlerin geliştirilmesi gibi yöntemler kolorektal kanser insidansı göz önünde bulundurulduğunda geniş bir kitle için önem arz etmektedir. Çalışmanın katkılarından biri, bu varyantın patojenik olarak yeniden sınıflandırılması gerektiğini ortaya koyarak, genetik tanı süreçlerine önemli bir referans sağlamasıdır. Günümüzde VUS'lar, genetik danışmanlık süreçlerinde büyük belirsizlik yaratmakta, bireylerin risk gruplarına dahil edilmesini ve önleyici sağlık hizmetlerinden faydalanmalarını zorlaştırmaktadır. Bu çalışma ile elde edilen bulgular sayesinde, MSH2 A733T gibi sık rastlanan varyantların fonksiyonel sonuçları aydınlatılarak, bu varyantlara sahip bireylerin klinik değerlendirme ve yönetim süreçleri netleştirilebilecek, böylece Lynch sendromu gibi ciddi kalıtsal hastalıklarda erken tanı ve koruyucu müdahaleler daha etkin bir şekilde planlanabilecektir. Ayrıca, bu çalışma yalnızca tanıya yönelik değil, tedaviye yönelik potansiyel katkılar da sunmaktadır. Mutant proteinin stabilitesinin düşmesi, bağlanma yüzeylerinin bozulması ve normal fonksiyonlarının kaybolması, hedefe yönelik terapötik stratejilerin geliştirilmesi için yeni fırsatlar sunmaktadır. Bu bağlamda, mutant proteine özgü inhibitör peptitlerin geliştirilmesi, anormal etkileşimlerin önüne geçerek hücredeki bozulmuş sinyal yollarının düzeltilmesini ve potansiyel olarak normal protein fonksiyonlarının yeniden kazanılmasını sağlayabilir. Böylece, kolorektal kanser başta olmak üzere ilgili mutasyonlara sahip bireyler için kişiye özel biyoteknolojik ilaçlar geliştirme yolunda önemli bir adım atılmış olacaktır. Gelecek perspektifi açısından, bu çalışma ile atılan temel üzerine inşa edilecek yapısal biyoloji temelli analizlerin büyük önem taşıdığı vurgulanmalıdır. MSH2 ve MSH6 proteinlerinin üç boyutlu yapılarının yüksek çözünürlüklü tekniklerle (örneğin X-ışını kristalografisi, cryo-EM veya moleküler dinamik simülasyonları) daha ayrıntılı şekilde incelenmesi, mutant varyantların etkileşim yüzeylerinde meydana gelen spesifik değişimlerin tanımlanmasına yardımcı olacaktır. Bu tür analizler, hedefe yönelik ilaç tasarımı açısından yüksek doğrulukta veri sağlayarak, hem VUS sınıfındaki varyantların daha etkin sınıflandırılmasına hem de biyoteknolojik müdahale yollarının geliştirilmesine katkı sunacaktır. Türk popülasyonunda sıkça görülen tekrarlayan varyantlar nedeniyle, hastalığın teşhisi, önleyici süreçler ve tedavisi için geniş bir kitleye ulaşması bu tez çalışmasını önemli kılmakla birlikte MSH2 geninde tespit edilen klinik olarak önemli bilinmeyen varyantın fonksiyonel analizleri sonucunda patojenik olarak değerlendirilmesi halinde genetik danışmanlık sağlama potansiyeli oluşturmakta ve klinik kararı vermeyi kolaylaştırmaktadır. Mutanta özgü ilaç geliştirilmesi kolon kanseri hastaları ve bu varyantı taşıdığı tespit edilen bireyler için kullanılabilecek biyoteknolojik ilaç potansiyeli taşımaktadır.

Özet (Çeviri)

The incidence of cancer is continually increasing, leading to adverse effects on public health and national economies. According to incidence and mortality, colorectal cancer is one of the most prevalent cancers in our nation and the world, with approximately 10% cases known to be hereditary. Lynch Syndrome is recognized as the most common hereditary cause of colorectal cancer. In our laboratory, we aimed to identify the mutation profiles in cancer predisposition genes specific to our population. Using next-generation sequencing technology, we performed a multi-gene panel test on 370 colorectal cancer patients, targeting mismatch repair (MMR) genes related with Lynch Syndrome (MSH2, MSH6, MLH1, and PMS2), along with other cancer susceptibility genes. The detected variants were interpreted based on the guidelines of the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). This study revealed that, due to its gene length, MSH2 is among the genes with the highest number of variants of uncertain significance (VUS) detected in colorectal cancer patients. In this thesis, the aim is to functionally characterize the recurrent MSH2 A733T VUS identified in the cohort and to provide additional evidence regarding its pathogenicity. Studies have highlighted the experimental challenges associated with working on this target protein and indicated a lack of comprehensive literature data. Within this project, the potential effects of the selected VUS on protein function were investigated, and supporting data for its reclassification were collected. To this end, both wild-type and mutant MSH2 gene were cloned into bacterial and mammalian expression vectors. The expression and purification processes of these proteins were optimized. Stability and secondary structure of proteins were assesed by circular dichroism. To carry out functional analyses, LoVo colorectal cancer cell line, which lacks endogenous MSH2, was used, and overexpression of wild-type and mutant hMSH2 proteins was achieved through transient transfection. Quantitative PCR and pathway protein analyses were used to evaluate the expression changes of MSH2 and its interacting partners at both gene and protein levels. Pull-down assays were performed to assess heterodimerization between MSH2 and its interaction partner MSH6. As MSH2 is known to activate cell death pathways when DNA damage is irreparable, the effect of the variant on cell viability was also examined. Functional analyses demonstrated that, compared to wild-type MSH2, the selected variant was less effective in activating proteins involved in cell death pathways, thus failing to induce apoptosis efficiently. These findings, together with structural analyses and molecular dynamics simulations, led to the formulation of a hypothesis on how increased protein stability may interfere with complex formation, prompting further investigation into the cellular response elicited by the mutant. These findings suggest that the variant may have a deleterious impact on tumor suppression and offer strong supporting evidence for its reclassification. Due to the frequent presence of recurrent variants in the Turkish population, this thesis study has significant implications for disease diagnosis, prevention, and treatment strategies. If the variant identified in the MSH2 gene is classified as pathogenic based on the functional assays, it may serve as a basis for offering genetic counseling and facilitating clinical decision-making. The classification of VUS not only as pathogenic/likely pathogenic but also as benign/likely benign will contribute to the literature and facilitate the reallocation of the effort and labor spent on analyzing these variants—both in our country and globally—toward the investigation of new and potentially more relevant variants. Moreover, the development of mutation-specific therapeutic agents has the potential to become a biotechnological treatment option for colorectal cancer patients and individuals carrying this variant.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    817610

    Investigation of the effects of supplementary therapy candidate molecules in breaking chemotherapy resistance in glioblastoma cells and retrospectively supporting the findings with primary tumors

    Glioblastoma hücrelerinde kemoterapi direncinin kırılmasında tamamlayıcı tedavi adayı moleküllerin etkilerinin araştırılarak bulguların retrospektif olarak primer tümörler ile desteklenmesi

    SENA FERAH

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    Tıbbi BiyolojiBursa Uludağ Üniversitesi

    Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. BERRİN TUNCA

  2. Tez No

    699574

    Kalıtsal meme kanseri tanısı almış olgularda DNA hasar onarımından sorumlu olan genlerdeki mutasyon sıklıklarının belirlenmesi ve hastalığın kötü prognozu ile ilişkisinin araştırılması

    Determination of mutation frequencies in genes responsible for dna damage repair in cases diagnosed with hereditary breast cancer and investigation of its relationship with poor prognosis of the disease

    SEDA KURU

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2021

    GenetikKocaeli Üniversitesi

    Tıbbi Genetik ve Moleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. NACİ ÇİNE

  3. Tez No

    1018915

    Molecular investigation of CHEK2 variants of unknown significance (VUS) found by genetic screening of breast and colorectal cancer patients and healthy individuals in Turkish population

    Türk popülasyonunda meme ve kolorektal kanser hastaları ile sağlıklı bireylerde genetik tarama ile saptanan klinik önemi bilinmeyen CHEK2 varyantlarının moleküler incelemesi

    NİSAN DENİZCE CAN

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2026

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)

    PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY

  4. Tez No

    883313

    Investigation of structural differences between wild-type and mutant forms of mutsα by molecular dynamics simulations

    Mutsα heterodimerinin yabanıl tip ve mutant formları arasındaki yapısal farklılıklarının moleküler dinamik simülasyonları ile incelenmesi

    CLARA XAZAL BURAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Biyomühendislikİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)

    DOÇ. DR. MERT GÜR

  5. Tez No

    246619

    Investigation of the effects of nicotine on the expression profile of SW620 colon adenocarcinoma cells using a functional genomics approach

    Nikotinin SW620 kolon adenokarsinom hücrelerinin gen ifade profili üzerine olan etkisinin işlevsel genomik yaklaşımlarla araşırılması

    ONUR KAYA

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2009

    Genetikİhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. ÖZLEN KONU

Geri Dön