Computational investigation of metal-protein interactions in yeast for bionanotechnology
Mayada metal-protein etkileşimlerinin biyonanoteknoloji için hesapsal olarak incelenmesi
- Tez No: 332985
- Danışmanlar: YRD. DOÇ. DR. BÜLENT BALTA, PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Mikrobiyoloji, Biotechnology, Genetics, Microbiology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2013
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Nanobilim ve Nanomühendislik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 79
Özet
Fet3p bir çoklu-bakır oksidaz enzimi olup, ekmek mayası olan Saccharomyces cerevisiae'da hücre içerisine yüksek afinitede demir alımında rol alır. Fet3p mayanın hücre zarının üzerinde Ftr1p proteini ile birlikte kompleks olarak bulunur. Fet3p dioksijen molekülünü suya indirgerken, aynı zamanda 4 demir(II) iyonunu birer birer yükseltgeyerek Ftr1p proteinine transfer eder. Ftr1p proteini de yükseltgenen demir iyonlarının hücre içerisine taşınmasını gerçekleştirir.Fet3p proteini kofaktör olarak 4 bakır iyonuna sahiptir. Bu 4 bakır spektroskopik özelliklerine göre 3 tipe ayrılır: T1, T2 ve T3(iki tane). Gerçekleşen reaksiyon döngüsü şu şekilde olmaktadır: Öncelikle, tamamen indirgenmiş yapıda (fully reduced state, bütün bakırlar +1 yüke sahip) dioksijen molekülü T2 ve T3'lerden oluşan üç çekirdekli kümeye(tri-nuclear cluster, TNC) gelir ve bağlanır. Bu aşamada çevresel değişikliklerle ve her bakırdan alınan bir elektron ve ortamdan alınan bir protonla dioksijen, O-2 ve OH- iyonlarına parçalanır. Böylece bütün bakırlar +2 durumuna yükseltgenirler ve bu aşamaya doğal ara yapı (native intermediate state) denir. Bu noktadan sonra 4 substrat demir(II) iyonu teker teker gelip birer elektron vererek bakır iyonlarını +1 durumlarına geri indirgerler. Bu demir oksidasyonları işlemleri esnasında ayrıca oksijen türevlerinde 4 protonlanma gerçekleşir ve iki su molekülü oluşur. Böylece tekrar tamamen indirgenmiş yapı elde edilir ve tüm döngü tekrar edilir.Literetürde tamamen indirgenmiş yapıdan, dioksijen ayrımına kadar olan tepkimeler ayrıntılı bir şekilde çalışılmıştır. Ancak, substrat oksidasyonu ve su oluşumu tepkimeleri daha önce hiç çalışılmamıştır. Bu yüzden bu çalışmanın başlıca amaçlarından biri, bu substrat oksidasyonu tepkimeleri, protonlanma etkileri ve olay sıralarının araştırılmasıdır.Fet3p proteinin ayrıca bakır(I) iyonlarını da substrat olarak alarak yükseltgediği deneysel olarak gösterilmiştir. Yapılan bakır stres çalışmalarda Fet3p, Cu+ iyonlarını daha az toksik olan Cu+2 iyonlarına yükseltgemiştir. Ayrıca, mayada yapılan diğer geçiş metal stresi çalışmalarında, Fet3p'nin bu streslere karşı dirençte rol aldığı görülmüştür. Kobalt ve nikel streslerine karşı Fet3p proteinin ekspresyonunun arttığı görülmüştür. Kobalt ve nikel için bu ekpresyon artışının iki nedeni olabilir: Ya bakırda olduğu gibi bu metalleri de yükseltgeyebilir ya da hücre içerisine demir alımını arttırarak bu metallerin demirle etkileşen proteinlerde demirin yerine geçmesini önleyebilir. Bu nedenle, bakır, kobalt ve nikel geçiş metalleri demir substratı ile yer değiştirilerek, Fet3p ile tepkimeye girip yükseltgenip yükseltgenemeyecekleri ve Fet3p proteininin substrat seçiciliğinin belirlenmesi de araştırmanın amaçlarından biridir.Proteinin iç bölgelerine erişim için T2 ve T3'ler tarafında olmak üzere iki tane solvent kanalı bulunmaktadır. Dioksijen T2 tarafındaki solvent kanalından gelir ve TNC bölgesine bağlanır. Tepkime sonunda oluşan suların hangi kanaldan ayrıldıkları ise daha önce tespit edilememiştir.Yapılan bu çalışmada Fet3p'nin doğal ara yapısından başlanmak üzere, başlangıç yapısı olan tamamen indirgenmiş yapıya gelene kadar olan tepkimeler araştırılmıştır. Bunun için kuantum mekaniği/moleküler mekanik (QM/MM) yöntemiyle olası tepkimelerin tepken ve ürün yapıları tasarlanmış ve optimize edilmiştir. Bu tepkimelerde gerçekleşen en önemli değişiklik metal iyonlarının yüklerindeki değişiklik olduğu için uygulanacak olan metodun seçilmesinde iyonizasyon enerjisini hesaplanması etkili faktör olmuştur. Metallerin iyonizasyon enerjisini en iyi şekilde hesaplayan M06-2X metodu optimizasyonlarda kullanılmak üzere seçilen yöntem olmuştur. M06-2X metodu bir hibrit yoğunluk fonksiyonel teori metodudur. Tepkimelerin tepken ve ürünlerinin optimize olmuş yapılarının elde edilmesi için iki aşamalı optimizasyonlar şu şekilde gerçekleştirilmiştir. Tepken ya da ürünün yapısına uygun olacak şekilde, proteinin iki kısmı -bakırlı bölge ve substrat bölgesi- ayrı ayrı optimize edilmiş daha sonra birleştirilip tekrardan optimize edilmiştir. Her bölgenin optimizasyonu esnasında diğer bölgedeki atomların konumları sabit tutulmuştur.Herhangi bir protonlanma olmaksızın yapılan hesaplarda, demirin protein tarafından yükseltgenme tepkime enerjisi endotermik olarak bulunmuştur. Ancak bir protonlanma gerçekleştiğinde, bu tepkime enerjisi endotermikten ekzotermik tarafa geçmiştir. Yalnızca bir proton eklendiği durumda ikinci substratın geldiği durumun denendiği yapılarda ise ürün yapısı elde edilememiştir. İkinci protonlanma ile ikinci substratın varlığındaki yapılar ise hala hesaplanma aşamasındadır. Üçüncü protonlanma ile üçüncü substratın varlığındaki yapılarda ise tepkime enerjisi ekzotermik olarak hesaplanmıştır. Üçüncü protonlamada dördüncü substratın tepken ve ürün yapısı elde edilmiş ve hesaplanan reaksiyon enerjisi endotermik olarak heaplanmıştır. Dördüncü protonlanma durumunda dördüncü substratın yükseltgenme tepkime enerjisi ise endotermik olarak hesaplanmıştır. Elde edilen verilere bakılarak, tepkimelerin şu şekilde gerçekleştiği düşünülmektedir: Önce bir protonlanma gerçekleşir, ardından bir substrat yükseltgenmesi meydana gelir. Bu döngü 4 defa tekrar ederek doğal ara yapıdan başlangıç yapısı olan tamamen indirgenmiş yapıya geri dönülür. Bu esnada gerçekleşen protonlanmalar sayesinde 2 su molekülü oluşur ve sistemi T3'ler tarafındaki solvent kanallarından terk ederler.Yapılan optimizasyonlarda, yükseltgenen demir iyonunun indirgenmiş demir iyonuna göre T1'den 0,2Å daha uzakta durduğu saptanmıştır. Demir iyonu yükseltgendikten sonra substrat-bağlanma bölgesinin çıkışına doğru ilerlemektedir. Bunun sebebi ise artan demir yükü ile pozitif bakırlı bölge arasındaki elektriksel itme etkileşiminden kaynaklanmaktadır.Diğer yandan Fet3p'nin substrat seçiciliğinin belirlenmesi için yapılan hesaplamalarda, Fet3p'nin bakırı da yükseltgediği görülmüştür. Bu sonuç da deneylerle tutarlılık göstermektedir. Hesaplama sonucu, tepkime enerjisi endotermik olarak hesaplanmasına rağmen benzeri demirli tepkime enerjisinden daha düşük enerjili bulunmuştur. Bunun sebeplerinin ise substrat bakırın indirgenmiş haldeyken Fet3p ile yaptığı etkileşimlerin demirden farklı olmasından, özellikle 345 numaralı metiyoninin kükürtüyle etkileşmesinden kaynaklandığı düşünülmüştür.Kobaltın demir yerine yerleştirilip yapılan hesaplamalarda ise ürün yapısı protonsuz yapılarda elde edilememiş ve dolayısıyla bu tepkimenin gerçekleşmediği düşünülmüştür. Ancak, uç bir durum olarak dizayn edilen, 4 protonlu yapıda ise ilk substrat kobaltın yükseltgendiği görülmüştür. Dolayısıyla, Fet3p'nin ancak uç koşullarda, düşük pH durumlarında kobaltı yükseltgeyebileceği düşünülmüştür. Ancak aynı yapıda 4. Substratın yükseltgenmediği de görülmüştür. Dolayısıyla bu tepkimenin demirli tepkimelerdeki kadar verimli olmadığı düşünülmüştür.Nikel demir ile yerdeğiştirildiğinde ise, tepkime gerçekleşmemiştir. Sadece substrat bağlama bölgesinin optimizasyonlarında nikelin +3 olması için yapılan girişimler Ni+2 olarak sonuçlanmıştır. Nikel substrat-bağlama bölgesindeki bir glutamattan bir elektron almış ve +2 yapısını oluşturmuştur. Dolayısıyla nikel bakırlar tarafından yükseltgense bile yakınındaki glutamattan bir elektron kopararak indirgenmiş yapısına geri dönecektir.Bu bağlamda, Fet3p, geçiş metalleri stresi koşullarında, bakırı daha az toksik olan formu olan Cu+2'ya yükseltgeyerek katkı yapar. Kobalt stresinde ise, Fet3p ancak düşük pH durumlarında kobaltı +3 haline yükseltger. Nikel stresinde ise Fet3p nikelle tepkimeye girmez.
Özet (Çeviri)
Fet3p is a multicopper oxidase protein found in yeast, Saccharomyces cerevisiae and responsible for the high affinity iron uptake into the cell. It is a membrane-bound protein and in complex with the Ftr1p protein. Fet3p reduces O2 into H2O by 4 substrate (iron) oxidations. Then the oxidized iron ions are transferred to Ftr1p, and Ftr1p transports the iron ions into the cell. In addition to the ferroxidase activity, the enzyme also shows cuprous oxidase activity.The enzyme has four copper cofactors in three types: T1, T2 and T3. All cofactor copper ions are in +1 state, at the beginning. Then the dioxygen comes and binds to the trinuclear copper cluster (formed by T2 and T3 coppers). The reduction of the O2 and the cleavage of the O-O bond occur by taking one electron from each copper ion. After dioxygen cleavage, the cofactor copper ions are in the +2 state. In order to return to the starting structure, 4 iron oxidations coupled with copper reductions occur. During these reactions, 4 protons come from the environment and the reduction derivatives of the dioxygen are converted to water.In the literature, there are bunch of informations about the reduction of dioxygen. However, from that point, the copper ion reductions by iron oxidations and protonations of the oxygen derivatives are not studied before. Therefore, these unstudied reactions and the order of these reactions are the interest of this study.The reactions are investigated computationally with quantum mechanics/molecular mechanics methods (QM/MM). M06-2X is the chosen density functional method for this study. The results show that the reactions do not seem the happen without any protonations. A possible mechanism of the reactions is proposed as follows: First a protonation occurs then a substrate oxidation occurs and this cycle repeats 4 times.On the other hand, in yeast, Fet3p contributes to resistance to transtion metal stresses other than Fe+2. In order to determine whether Fet3p can oxidize other transiton metals as well, Fe+2 has been replaced with Cu+, Co+2 and Ni+2 and the reaction energies have been calculated. Consistent with experiments, Fet3p oxidizes Cu+ ion to a less toxic form, Cu+2. On the other hand, the enzyme oxidizes cobalt ions only under extremly low pH conditions. In the case of nickel as the substrate, Fet3p cannot oxidize the substrate. Thus, the resistance mechanism for Co and Ni, does not involve oxidation of these metals.
Benzer Tezler
- Moleküler modelleme yöntemleri kullanılarak bazı enzim ve proteinlerin alosterik etki ile inhibisyon ve aktivasyonlarının araştırılması
Investigation of inhibition and activation of some enzymes and proteins by allosteric effect using molecular modeling methods
MEHMET MURAT YAŞAR
Doktora
Türkçe
2022
Fizik ve Fizik MühendisliğiAkdeniz ÜniversitesiFizik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. İSMAİL HAKKI SARPÜN
PROF. DR. EROL EROĞLU
- EU3+ ve Tb3+ iyon ve şelatlarının lüminesans yöntemlerle incelenmesi ve serum albumin, fibrinojen gibi biyomoleküllerin etkilenmesi
Investigation of Eu (III) and Tb (III) ions, chelates and their interaction with serum albumine, fibrinojen as using luminescence techniques
OKAN OKTAR
- Computational investigation of reaction mechanism of FET3 protein in yeast
Mayadaki FET3 proteininin reaksiyon mekanizmasının hesapsal olarak incelenmesi
BÜŞRA AHISHALI
Yüksek Lisans
İngilizce
2023
Biyokimyaİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ BÜLENT BALTA
- Biochemical, biophysical and kinetic characterization of haemophilus influenzae ferric binding protein
Haemophılus ınfluenzae demir bağlayan proteinin biyokimyasal, biyofiziksel ve kinetik karakterizasyonu
GÖKŞİN LİU
Doktora
İngilizce
2022
BiyofizikSabancı ÜniversitesiMalzeme Bilimi ve Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZEHRA SAYERS
PROF. DR. CANAN ATILGAN
- Investigation of biologically important small molecules: Quantum chemical and molecular dynamics calculations
Biyolojik öneme sahip küçük moleküllerin kuantum kimyasal ve moleküler dinamik hesaplamalarla incelenmesi
EMİNE DENİZ TEKİN
Doktora
İngilizce
2010
Fizik ve Fizik MühendisliğiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiFizik Bölümü
PROF. DR. SAKİR ERKOÇ