Separation and purification of recombinant proteins by using ultrafiltration membranes
Ultrafiltrasyon membranları ile rekombinant proteinlerin ayırımı ve saflaştırılması
- Tez No: 473266
- Danışmanlar: DOÇ. DR. PINAR ZEYNEP ÇULFAZ EMECEN, PROF. DR. PINAR ÇALIK
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Kimya Mühendisliği, Chemical Engineering
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2017
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 103
Özet
Membrana dayalı yöntemler ayırma süreçlerinde gittikçe daha önemli bir yere sahip olmakta ve su arıtımı, gıda endüstrisi ve biyoteknoloji gibi bir çok alanda kullanılmaktadır. Ultrafiltrasyon, düşük enerji ve kimyasal kullanımı ve kolay ölçeklendirilebilmesi gibi üstün özellikleri sayesinde kristallendirme ve kromatografi gibi geleneksel yöntemlere kıyasla biyo-ayırma alanında alternatif bir yöntem olabilir. Rekombinant proteinlerin fermentasyon ortamından ultrafiltrasyon membranları ile ayrılması kapsamında iki ayrı üretim ortamı seçilmiştir. İlk üretim ortamı insan büyüme hormone (rhGH) içermektedir. Boyuta bağlı, selüloz mebranlarla yapılan ayırımda, istenilen ürün olan hGH'nin membran tarafından özellikle tutulduğu görülmüştür. hGH'nin bu denli tutulması hGH molekülünün kümeleşmesinden kaynaklı olabilir. Buna ek olarak hGH yüksek oranda tutulurken, yüksek molekül ağırlığındaki proteinler süzüntü kısmına geçmiştir. Bu üretim ortamında hGH hücre dışında üretilmektedir, bu yüzden tuzlar dahil bütün metabolitler besleme çözeltisinde bulunmaktadır. Ortamda tuzların bulunması, elektriksel çift katmanını azalttığı için proteinlerin geçişini arttırabilmektedir. Ayırma performansını arttırmak amacıyla pH değişikliği ve membran yüzeyi modifikasyonu gerçekleştirilmiştir. Bu deneylerin sonucunda, besleme çözeltisinin pH değişiminin ayırmayı önemli ölçüde değiştirmediği ancak pozitif modifiye edilmiş membranın bütün proteinlerin tutulmasını arttırdığı görülmüştür. Bu üretim ortamı için ayırma davranışı üzerindeki etkisini anlayabilmek için diafiltrasyon deneyleri de yürütülmüştür. Ayırma performansının artmasına rağmen, ilk filtrasyon setinde hGH'nin yüksek oranda tutulduğu gözlemlenmiştir. Buna ek olarak selüloz membranlarında diafiltrasyon sonucunda hasar meydana geldiğinden kuşkulanılmış bu nedenle de PES membranları ile filtrasyon da denenmiştir. Ancak yine de hGH yüksek oranda tutulmuş ve beklenmedik şekilde yüksek melekül ağırlıklı proteinler geçmiştir. Hücre içi yolla üretilen rekombinant Granulocyte-Colony Stimulating Factor (rGCSF) içeren ikinci üretim ortamı, santrifüj ve üre ile yıkama gibi birkaç ön işlemden sonra besleme çözeltisi olarak ultrafiltrasyon deneylerinde kullanılmıştır. Hem 100 kDa hem de 30 kDa MWCO membran filtrasyonlarında boyuta bağlı ayırıma bir noktaya kadar ulaşılmıştır. İstenilen proteinin daha ileri ayırımı için, besleme çözeltisinin pH'ı değiştirilmiş ve pH 5.2'ye eşit olduğunda ve 100 kDa'luk membranla yapılan filtasyon sonucunda alınan süzüntü örneklerinin 30 kDa'luk membrane filtrasyonu için besleme çözeltisi olarak kullanıldığı durumda en iyi sonuca ulaşıldığı gözlenmiştir. Sonuç olarak, hGH ortamında, hGH her durumda seçici olarak tutulmuştur. Öte yandan GCSF ortamında, GCSF özellikle pH 5.2'ye eşit olduğunda diğer proteinlere göre seçiciliğe sahiptir.
Özet (Çeviri)
Membrane based processes have an increasing role in separation processes and used in many industrial areas like water treatment, food industry and biotechnology. Ultrafiltration can be an alternative to conventional techniques such as crystallization and chromatography due to superior advantages such as having low energy and chemical consumption and easy scale up in the field of bioseparation. Within the scope of the separation of the recombinant proteins from fermentation environment by using ultrafiltration membranes, two separate production media were considered. First production media contained recombinant human growth hormone (rhGH). In size based separation with cellulose membranes, it was observed that desired product, hGH, was specifically retained by the membrane. High retention of the hGH could arise from the agglomeration of the hGH molecule. Furthermore, larger molecular weight proteins passed to the permeate side whereas hGH was highly retained. In this environment, hGH was produced extracellularly so, all metabolites including salts were present in the feed solution. Presence of the salts may have made the permeation of the proteins easier since they decreased the electrical double layer thickness of the proteins. To improve separation performance, pH change and modification on membrane surface were performed. As a result of these experiments, changing pH of the feed solution did not affect the separation significantly but the positively modified membrane increased the retention of all proteins. For this production medium, diafiltration was also conducted to investigate the effect on separation behavior. Although separation performance increased, high rejection of hGH was observed from first set of the filtration. In addition to that, PES membranes were tried for filtrations due to suspected damage of cellulose membranes at the end of the diafiltration. However, there was still high retention of hGH and unexpected permeation of the larger molecular weight proteins. Second production medium containing recombinant granulocyte-colony stimulating factor (rGCSF) which was produced intracellularly, was used as feed solutions in ultrafiltration experiments after centrifugation and washing step with urea solution. In both 100 kDa and 30 kDa MWCO membrane filtration case, size based separation was achieved to some extent. For further separation of the desired protein, GCSF, pH of the feed solution was adjusted to different pH values and it was observed that the best result was achieved when the pH was 5.2 and permeate samples of the 100 kDa membrane filtration were used as feed solution for 30 kDa membrane filtration. Consequently, in hGH environment, hGH was selectively rejected by the membrane in any case. On the other hand, in GCSF environment, GCSF had selectivity over the other proteins in the pH range 4-6.5 especially in the case of pH was equal to 5.2.
Benzer Tezler
- Expression, purification and characterization of high-fidelity DNA polymerase
Yüksek-duyarlı DNA polimeraz enziminin üretilmesi, saflaştırılması ve karakterizasyonu
KÜBRA TÜRK
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
- Analysis and characterization of the Pichia pastoris secretome for pharmaceutical protein production
Pichia pastoris sekretomunun farmasötik protein üretimi için analizi ve karakterizasyonu
HATİCE PINAR KIRLI
Yüksek Lisans
İngilizce
2019
BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ HARUN KOKU
PROF. DR. PINAR ÇALIK
- Rekombinant insan insülininin oral multipl emülsiyon formülasyonunun geliştirilmesi üzerinde çalışmalar
Studies on the development of oral multiple emulsion formulations of recombinant human insulin
HOCAMURAT HUDAYBERDİYEV
- Expression, purification, and characterization of soluble recombinant TNFR1
Çözünür rekombinant TNFR1'in üretimi, saflaştırılması ve karakterizasyonu
DERYA HATİPOĞLU
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
- Purification of Pst I endonuclease from providencia stuartii 164
Pst I endonükleazının providencia stuartii 164'den saflaştırılması
ERDEM FEHMİ ÇELİK
Yüksek Lisans
İngilizce
2001
Kimya MühendisliğiBoğaziçi ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. KUTLU ÜLGEN
