Selection and validation of aptamers against osteosarcoma by cell-selex method
Osteosarkoma karşı aptamerlerin hücre-selex yöntemi ile seçimi ve sınanması
- Tez No: 540521
- Danışmanlar: DOÇ. DR. EDA ÇELİK AKDUR, DOÇ. DR. LIGIA RODRIGUES
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Moleküler Tıp, Mühendislik Bilimleri, Onkoloji, Molecular Medicine, Engineering Sciences, Oncology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2019
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Hacettepe Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 95
Özet
Osteosarkom, en sık görülen malign mezenkimal kök hücrelerden, endokondral ossifikasyon yoluyla gelişen kemik tümörü olarak bilinir. Bu tür agresif pediatrik kemik kanserinin erken teşhisi dolayısıyla erken tedavisi, hastanın sağ kalma yüzdesini arttırmaktadır. Bunun için antikor üretiminden daha ucuz ve stabil bir alternatif ürün olarak aptamerler sunulmuştur. Kısa nükleotid dizilerinin sentetik olarak tasarlanabilmesi ve ilgili hücre reseptörünü hedef alarak teşhis veya teröpatik etki gibi farklı amaçlar için kullanılabilmesi gibi özellikleri, bir çok araştırmacının ilgisini çekmektedir. Aptamerler, küçük organik moleküllerden proteinlere kadar çeşitli hedeflere bağlanabilen, tek zincirli DNA veya RNA oligonükleotidleridir. Tek zincirli oligonükleotid kütüphaneleri teorik olarak çeşitli tipte hedef moleküller ile kombine edilebilen üç boyutlu yapıları oluşturabilirler. Aptamerler, eğer hedef bilinirse SELEX (Ligandların Üstel Zenginleştirme ile Sistematik Evrimi) veya hedef bilinmiyorsa Hücre-SELEX ile seçilebilir. Hücre-SELEX, tüm hücreleri hedef olarak kullanarak aptamer seçimine olanak sağlar. Aptamerlerin avantajları arasında tekrar edilebilir denatürasyon ve renatürasyonu, döngüleri boyunca hedefe tutulan aptamerlerin kimyasal modifikasyonlarının kolay sentezi ve korunması bulunmaktadır. Bu tez çalışmasında, 80-100 nt aptamer (ssDNA) kütüphanesi tasarlanmış, karşı-seçim için osteoblast hücreleri (normal kontrol hücreleri) kullanılarak osteosarkoma hücrelerini (MG-63) özel olarak tanıyan, yüksek selektivite ve duyarlılığa sahip aptamerler, hücre-SELEX yöntemi ile seçilmiştir. Çalışmada ayrıca, aptamerlerin çoğalması için vektör sisteminin tasarlanması, potansiyel aptamerlerin sekans ve homoloji analizinin ardından, akış sitometrisi ve konfokal mikroskopi analizleri de gerçekleştirilmiştir. Hücre-SELEX metodolojisi ile, onuncu zenginleştirme basamağı sonrasında, MG-63'e karşı aptamer'i başarıyla ve ilk kez üretmiş bulunuyoruz. Otuz altı potansiyel diziden 14 tanesi tam boyda olup, bunlardan 3'ü akış sitometrisi ile analiz edilmiştir, ve ileri analizler için içlerinden biri seçilmiştir. Seçilen aptamer, osteoblast ve diğer kanser hücrelerine kıyasla MG-63'e karşı nM (Kd=11.9±0.9 nM) düzeyinde özgüllük göstermektedir. Konfokal mikroskop analizinde, aptamerin 37C'de hücre içine girdiği, 4C'de ise hücre membranında biriktiği tespit edilmiştir. Aptamerin bu ikili özelliği, 37C'de tedavi için (ilgili herhangi bir reseptör veya kanser proliferasyonunu engellediği bulunursa) ve 4C'de teşhis için (örneğin, floresan bir molekül takılırsa) kullanılabileceğini göstermektedir. Genel olarak, burada seçilen ve osteosarkoma karşı karakterize edilen aptamer, osteosarkoma teşhis ve tedavisi için yüksek seçiciliği ve duyarlılığı göz önüne alındığında, güçlü ve değerli bir araçtır.
Özet (Çeviri)
Osteosarcoma is known as the most common malignant mesenchymal stem cell development by endochondral ossification. Treatment resulting from an early diagnosis of such aggressive pediatric bone cancer can greatly increase the survival rate of the patient. For this purpose, aptamers comprise a cheaper and stable alternative product compared to antibodies. The ability of these short nucleotide sequences to be synthetically designed and used either for diagnostic or therapeutic purposes by targeting the relevant cell receptors has been attracting the interest of many researchers. Aptamers are single-chain DNA or RNA oligonucleotides that bind to a variety of targets, from small organic molecules to proteins. Single-chain oligonucleotide libraries can theoretically form three-dimensional structures that can be combined with various types of target molecules. Aptamers can be selected through SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) if the target is known or cell-SELEX if the target is unknown. Cell-SELEX enables aptamers selection using whole cells as a target. Advantages of aptamers include repeatable denaturation and renaturation, easy synthesis and preservation of chemical modifications of the targeted aptamers throughout the selection cycles. In this thesis, a 80-100 nt aptamer (ssDNA) library was designed to select by cell-SELEX, aptamers that specifically recognize the osteosarcoma cell line (MG-63) with high selectivity and sensitivity using osteoblast cells (control normal cells) for counter-selection. The work also include designing the vector system for proliferation of aptamers, sequence and homology analysis of the potential aptamers followed by flow cytometry and confocal microscopy. We have successfully generated an aptamer against MG-63 cells for the first time, after 10 cycles of enrichment using cell-SELEX. Out of 36 potential sequences, 14 sequences were full-length, and out of these, three aptamer sequences were analyzed by flow cytometry and one aptamer was selected for further analysis. This aptamer was found to be specific against MG-63 cells as compared to osteoblasts and other cancer cell lines, exhibiting a nanomolar range Kd value, namely 11.9±0.9 nM. Internalization of the aptamer was observed by confocal microscopy when MG-63 cells were incubated with the aptamer at 37C, but not at 4C. This dual characteristic of the selected aptamer highlights its potential to be used for treatment at 37C (in case it is found to interfere with any relevant receptor or cascade inhibiting cancer proliferation) and for diagnostics at 4C (if coupled for instance with a fluorescence molecule). Overall, the aptamer herein selected and characterized against osteosarcoma is a powerful and valuable tool for its detection and treatment, given the high selectivity and sensitivity of the aptamer.
Benzer Tezler
- Karsinoembriyonik antijen tayini için aptamer esaslı yöntemlerin geliştirilmesi
Development of aptamer-based methods for determination of carcinoembrionic antigen
ASLI ERKAL AYTEMUR
Doktora
Türkçe
2023
KimyaNecmettin Erbakan ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. İBRAHİM ENDER MÜLAZIMOĞLU
PROF. DR. ZAFER ÜSTÜNDAĞ
- Nauphoeta cinera (Olivier, 1789) (Blattodea, blaberıdae) türündegerçek zamanlı RT-qPCR ile kantitatif ekspresyon analiziiçin referans genlerin tanımlanması ve doğrulanması
Identification and verification of reference genes for quantitative expression analysis by real-time RT-qPCR in nauphoeta cinera (Olivi̇er, 1789) (Blattodea, blaberidae)
KÜBRA ÖZCAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
BiyolojiSivas Cumhuriyet ÜniversitesiMoleküler Biyokimya ve Genetik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ ŞEYDA BERK
- Kimyasallarla indüklenen meme kanseri oluşum mekanizmalarında olası antikanser ilaç hedeflerinin araştırılması
Investigation of mechanisms of chemically-induced breast cancer as targets for anticancer drugs
ELİF İNCE
Doktora
Türkçe
2018
Eczacılık ve FarmakolojiEge ÜniversitesiFarmasötik Toksikoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. HANDE GÜRER ORHAN
- Measuring climate for innovation in teamwork: Adaptation and validation of Team Climate Inventory (TCI) into Turkish
Ekip çalışmasında yenilik ortamını ölçmek: Ekip Ortamı Envanteri'nin Türkçeye uyarlanması ve geçerliliğini ölçmek
ABBAS YAGHOBİ
Yüksek Lisans
İngilizce
1998
İşletmeMarmara Üniversitesiİşletme (İngilizce) Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. HANDAN KEPİR SİNANGİL
- Caenorhabditis elegans oosit ve embriyolarında global mikroRNAom profillerinin analizi
Analisis of global mikroRNAome profiles in Caenorhabditis elegans oocyte and embryos
SELEN GÜÇLÜ
Yüksek Lisans
Türkçe
2013
BiyolojiAnkara ÜniversitesiTemel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ARZU ATALAY