Geri Dön

Mikotoksinlerin mezenkimal kök hücrelerinin sağkalımı ve bölünmesi üzerindeki etkilerinin transkriptomik düzeyde taranması

Screening of mycotoxin-induced effects on the survival and proliferation of mesenchymal stem cells at transcriptomic level

PDF İndir

  1. Tez No: 804347
  2. Yazar: INJI SHIKHALIYEVA
  3. Danışmanlar: PROF. DR. GÜLRUH ALBAYRAK, DOÇ. DR. CENK KIĞ
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoloji, Genetik, Mikrobiyoloji, Biology, Genetics, Microbiology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2023
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: İstanbul Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 158

Özet

Doktora tezinde, Fusarium mikotoksinlerinden deoksinivalenolün (DON) insan mezenkimal kök hücrelerinin (MKH) sağ kalımı ve çoğalması üzerindeki olası etkileri hücresel ve moleküler yaklaşımlarla araştırıldı. Diş pulpası kök hücreleri (DPKH), 6 kadın ve 6 erkek bireyden çekilen gömük sağlıklı 20 yaş dişlerinden izole edildi. İğsi morfolojileri Giemsa boyaması ile gösterilen hücrelerin ikilenme süresinin 32 saat olduğu belirlendi. Beşinci pasaja (P5) ulaşan DPKH'lerin karakterizasyonu akış sitometrisinde MKH pozitif yüzey markırlarından CD90, CD29 ve CD73, negatif yüzey markırlarından CD45 ve CD34 taranarak gerçekleştirildi. Pozitif yüzey markırlarının %95-99.9, CD45'in de %0.05-0.9 değer aralığında DPKH'lerde taşındığı belirlendi. CD34'ün %2.57-83.86 değer aralığında belirlenmesi bu markırın DPKH'lerde çok geniş değer aralığında taşınabileceğini gösterdi. İzole edilen DPKH'lerin multipotensi özellikleri, osteojenik ve adipojenik farklılaşmaları teşvik edildikten sonra alizarin red S boyaması ile gösterilen kırmızı renkteki mineralizasyon bölgeleri ve oil red O boyaması ile gösterilen hücre içi yağ damlacıkları ile ortaya kondu. DON'un DPKH'lerin sağkalımı üzerindeki etkisi MTT analizi ile araştırıldı. Öncelikle asetonitrilin 0.4-3.2 μg/ml konsantrasyon aralığında DPKH'ler üzerinde toksik etkili olmadığı belirlenerek mikotoksinin çözücüsü olarak uygunluğu ortaya kondu. DON'un toksik etkisi ile hücre yoğunluğu arasındaki ilişki %50 ve %80 yoğunluktaki DPKH P5 kültürlerine 0.25-4 µg/ml aralığında DON uygulaması ile araştırıldı. %50 hücre yoğunluğunun toksisite çalışması için daha uygun olduğu gösterildi. %50 yoğunluktaki DPKH P5 kültürleri DON'un 0.25-2 µg/ml dozlarına 24, 48, 72 ve 96 saat süre ile maruz bırakılarak mikotoksinin maksimum inhibitör konsantrasyonunun yarısını temsil eden dozu (IC50) MTT analizi ile 0.46 µg/ml olarak hesaplandı. IC50 dozunun farklılaşma sürecini tamamlamış L929 stabil hücre hattı üzerinde ise sadece %30 hücre inhibisyona neden olduğu gösterildi. DPKH'lerin ikilenme süresinden dolayı mikotoksinin sağkalım ve bölünmesi üzerindeki etkilerinin ilk 48 saat içerisinde çalışılması gerektiği sonucuna ulaşıldı. DON IC50'nin ilk 48 saat içerisinde DPKH'lerin ölümüne yol açmadığı akridin turuncusu-etidyüm bromür boyaması sonrası fluoresan mikroskobu incelemesi ve anneksin V-propidium iyodür boyaması sonrası akış sitometri analizi ile gösterildi. DON uygulanmış kültürlerde kontrole benzer şekilde canlı hücre oranları %90'nın üzerinde, apoptotik ve nekrotik hücre oranları ise %5'in altında bulundu. Kontrol ile deney grubunun hücre canlılığı arasında istatistiksel olarak anlamlı fark olmadığı t-testi ile gösterildi. Apoptoz süreci ile ilgili proapoptotik Bax, antiapoptotik Bcl2 ve Bcl-xL, hücresel yapıların yıkımını koordine eden Cas3 genlerinin anlatım düzeyleri qPZR analizi ile ve Cas3 proteininin düzeyleri Western blot analizi ile araştırıldı. 24. saatte deney grubunda Bcl2 anlatım düzeyinin yaklaşık 2 kat arttığı, Bax, Bcl-xL ve Cas3 anlatım profillerinin ise kontrol ile benzerlik gösterdiği ve aralarında istatistiksel olarak fark olmadığı saptandı. 48. saatte Bcl-xL anlatımı kontrole kıyasla azalırken, Bcl2, Bax ve Cas3 gen anlatımları arasındaki farkın anlamlı olmadığı saptandı. Cas3 protein düzeyleri arasında da istatistiksel olarak fark saptanmadı ve IC50 dozunun DPKH kültürlerinde apoptoza ve nekroza neden olmadığı desteklendi. 2',7'-diklorofloresin diasetat (DCF-DA) boyaması sonrası DON IC50 dozunun ilk 48 saat içerisinde DPKH'lerde oksidatif stres düzeyini önemli ölçüde arttırmadığı fluoresan mikroskobunda izlendi ve kontrol ile deney grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmadığı spektroflorometrik ölçüm ile belirlendi. Ancak oksidatif stres sürecinde rol alan antioksidan enzimleri kodlayan CAT gen anlatımının kontrole göre azaldığı, SOD2 anlatımının ise arttığı saptandı. PI boyaması sonrası akış sitometrisi analizi ile DPKH kültürlerinde 24. saatte, G0, G1, S ve G2/M fazlardaki kontrol ve deney grubu hücre oranları arasında istatistiksel olarak anlamlı farkın olmadığı, 48. saatte ise deney grubunda G2/M fazındaki hücre oranlarının kontrole kıyasla (%8.2±0.03) önemli ölçüde (%31±0.06) arttığı saptandı. qPZR analizi, 48. saatte hücre döngüsü kontrol noktalarında görevli Cdk1, Siklin B1 ve p53 genler arasından p21'in anlatım düzeyinde 6 katlık artışı belirlemeyi sağladı. Western blot analizi, 24 saatte mikotoksin maruziyetinin her iki fraksiyonda da p21 oranını azalttığını ortaya koydu. Bununla birlikte, 48 saatlik maruz kalma, sitoplazmik fraksiyonda yaklaşık 3.5 kat azalmaya, nükleer fraksiyonda ise 6 kat artışa yol açtı. Bulgular DON'un hücre döngüsünü p53'ten bağımsız p21 yoluyla G2/M fazında tutukladığını ortaya koydu. Tez çalışmasında ilk defa DON'un DPKH'lerin osteojenik ve adipojenik farklılaşmasına etkileri araştırıldı ve farklılaşmanın teşvik edilmediği ortamda DON'un p21 ile birlikte osteojenik (BMP2) ve adipojenik (C/EBPβ) farklılaşma markırlarının anlatımını yükselttiği belirlendi. Çalışmadan elde edilen bulgular, MKH toksisite çalışmasında hücre yoğunluğunun önemini göstermesinin yanı sıra, hücre hattı ile farklılaşmamış primer kültür arasındaki farkı da ortaya koydu. Aynı zamanda bu çalışma, DON'un MKH'lerin sağkalımı, proliferasyonu ve farklılaşması süreçleri üzerindeki etkileri ile ilgili önemli veriler sundu. Doktora tezi, temel bilimlere önemli katkı sağlamakla beraber, mikotoksinlerin dokularda rejenerasyondan sorumlu ve hücre terapisinde kullanılan MKH'lerin üzerindeki toksik etkileri ile ilgili, aynı zamanda uzun süreli DON etkisinin DPKH'lerin farklılaşması üzerindeki etkisinin taranması, DON'un DPKH'lerin nöronlara farklılaşma potansiyelleri kullanılarak nörojenik farklılaşma sürecindeki etkilerinin taranması, p21 bağımlı etkilerinin mitokondri yolağı üzerinden aydınlatılabilmesi yolunda yeni projelere zemin hazırlaması açısından büyük önem taşımaktadır.

Özet (Çeviri)

In this doctoral thesis investigated the possible effects of one of the Fusarium mycotoxins deoxynivalenol (DON), on the survival and proliferation of human mesenchymal stem cells (MSCs) using cellular and molecular approaches. Dental pulp stem cells (DPSCs) were isolated from impacted healthy 20-year-old teeth extracted from 6 female and 6 male individuals. The spindle-like morphology of cells was shown via Giemsa staining and the doubling time of cells was calculated as 32 hours. Characterization of DPSCs reaching the fifth passage (P5) was performed by scanning CD90, CD29 and CD73 as positive, and CD45 and CD34 as negative surface markers of MSC using flow cytometry. It was determined that in DPSCs positive surface markers were carried in the range of 95-99.9% and CD45 in the range of 0.05-0.9%.The determination of CD34 in the range of 2.57-83.86% showed that this marker can be carried by DPSCs in a wide range of values. The multipotency properties of isolated DPSCs after promoting osteogenic and adipogenic differentiation were presented via the red mineralization regions by alizarin red S staining and intracellular oil droplets by oil red O staining. The effect of DON on the survival of DPSCs was investigated by MTT analysis. Firstly, the non-toxic concentration range of acetonitrile on DPSCs was determined as 0.4-3.2 μg/ml, and its suitability as a mycotoxin solvent was confirmed. The relationship between the toxic effect of DON and cell confluency was investigated by applying DON in the range of 0.25-4 µg/ml to P5 DPSCs cultures at 50% and 80% confluency. The cells at 50% confluency were shown to be more suitable for toxicity study. P5 DPSCs cultures at 50% confluency were exposed to 0.25-2 µg/ml doses of DON for 24, 48, 72 and 96 hours, and the dose (IC50) representing half of the maximum inhibitory concentration of mycotoxin was calculated as 0.46 µg/ml by MTT analysis. It was shown that the IC50 dose caused only 30% cell inhibition on the terminally differentiated L929 stable cell line. It was concluded that the effects of mycotoxin on survival and proliferation should be studied within the first 48 hours due to the doubling time of DPSCs. Fluorescent microscopy examination after acridine orange-etidium bromide staining and flow cytometry analysis after annexin V-propidium iodide staining revealed the fact that DON IC50 did not cause the death of DPSCs within the first 48 hours. Similar to the control, viable cell ratios were found above 90% in cultures treated with DON, and the ratios of apoptotic and necrotic cells were below 5%. The statistically non-significant difference between the cell viability of the control and experimental groups was shown using the t-test. Expression levels of proapoptotic Bax, antiapoptotic Bcl2 and Bcl-xL, the Cas3 genes that coordinate the destruction of cellular structures were investigated by qPCR analysis and the levels of cas3 protein were investigated by Western blot analysis. It was determined that the expression level of Bcl2 in the experimental group increased approximately 2 times at the 24th hour, while expression profiles of Bax, Bcl-xL and Cas3 were similar to those of the control group and there was no statistical difference between them. While Bcl-xL expression decreased at the 48th hour, compared to the control, the difference between Bcl2, Bax and Cas3 gene expressions was not found to be significant. There was no statistical difference between Cas3 protein levels, and it was approved that the IC50 dose did not cause apoptosis and necrosis in DPSC cultures. After 2',7'-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA) staining, it was observed under fluorescence microscopy that IC50 dose of DON did not significantly increase the oxidative stress level in DPSCs during the first 48 hours, and the statistically non-significant difference between the control and experimental groups was determined by spectrofluorometric measurement However, it was determined that the expression of the CAT gene, which encodes the antioxidant enzymes involved in the oxidative stress process, decreased compared to the control, and the expression of SOD2 increased. After PI staining, flow cytometry analysis demonstrated, that at the 24th hour was statistically a non-significant difference between control and experimental group cell ratios at G0, G1, S, and G2/M phases, and at the 48th hour of DPSC cultures was a significant increase in experimental group cells (31±0.06%) at G2/M phases in contrast to the control group (8.2%±0.03). qPCR analysis enabled the detection of a 6-fold increase in p21 expression level among Cdk1, Cyclin B1 and p53 genes involved in cell cycle checkpoints at 48 hours. Western blot analysis revealed that mycotoxin exposure at 24 hours decreased the p21 ratio in both fractions. However, 48 hours-exposure led to decreasing approximately 3.5-fold in the cytoplasmic fraction, while increasing 6-fold the nuclear fraction. The findings revealed that DON arrests the cell cycle in the G2/M phase via p53-independent p21. For the first time, the effects of DON on osteogenic and adipogenic differentiation of DPSCs were investigated and it was determined that DON increased the expression of osteogenic and adipogenic differentiation markers (BMP2 and C/EBPβ, respectively) together with p21 in the environment where differentiation was not induced, in this study. The findings obtained from the study showed not only the importance of cell density in the MSC toxicity study, but also revealed the difference between the differentiated cell line and the undifferentiated primary culture. At the same time, this study presented important data on the effects of DON on the processes of survival, division and differentiation of MSCs. The doctoral thesis, besides making an important contribution to basic sciences, has great importance in terms of laying the groundwork for new projects such as the determination of the toxic effects of mycotoxins on MSCs, which are responsible for regeneration in tissues and used in cell therapy, screening the effect of long-term DON treatment on the differentiation of DPSCs, scanning the effects of DON on the neurogenic differentiation process by using the differentiation potential of DPSCs to neurons, elucidating the p21-dependent effects through the mitochondrial pathway.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    299476

    Mikotoksinlerin, çözücü karışımları ve toksin bağlayıcılarla kimyasal ilgi ve çözünürlük profillerinin belirlenmesi

    Chemical affinities and solubility profiles between mycotoxins, toxin binders and solvent mixtures

    NİLÜFER ÇANKAYA

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2011

    Gıda MühendisliğiHacettepe Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ALİ GÜNER

  2. Tez No

    376361

    Adsorption of mycotoxins by zeolites and organo-zeolites

    Mikotoksinlerin zeolit ve organo-zeolitlerle adsorpsiyonu

    TÜRKER PASİNLİ

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2013

    KimyaEge Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. EMÜR HENDEN

  3. Tez No

    284212

    Bazı mikotoksinlerin Drosophila melanogaster'de oluşturdukları genotoksik etkiler üzerine Teucrium polium bitkisinin antigenotoksik etkilerinin araştırılması

    Investigation of antigenotoxic impacts of plant Teucrium polium on genotoxic impacts formed by some mycotoxins in Drosophila melanogaster

    MEHMET GÜRBÜZEL

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2011

    BiyolojiAtatürk Üniversitesi

    Biyoloji Bölümü

    DOÇ. DR. HANDAN UYSAL

  4. Tez No

    539296

    Yaygın mikotoksinlerin ammonizasyonla eliminasyonu

    Elimination of mycotoxins by the ammoniation method

    VEYSEL DOĞAN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    Besin Hijyeni ve TeknolojisiAtatürk Üniversitesi

    Hayvan Besleme ve Beslenme Hastalıkları Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ARMAĞAN HAYIRLI

  5. Tez No

    212509

    Bazı mikotoksinlerin detoksifikasyonunda Lactobacillus ve Bifidobacterium suşlarının kullanımı

    Using of Lactobacillus and Bifidobacterium strains for detoxification of some mycotoxins

    BÜLENT KABAK

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2007

    Gıda MühendisliğiÇukurova Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. IŞIL VAR

Geri Dön