Purification and characterization of cytoplasmic andproteasome associated chymotrypsin-like proteases fromthermoplasma volcanium
Termoplazma volcanyum'dan sitoplazmik ve proteazom ile ilgili şimotripsin benzeri proteazların saflandırılması ve karakterizasyonu
- Tez No: 807973
- Danışmanlar: PROF. SEMRA KOCABIYIK
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Mikrobiyoloji, Biyoloji, Biyoteknoloji, Microbiology, Biology, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: 20 S proteazom, Bakteri proteinleri, Mikrobiyal enzimler, Serin alkali proteaz, Toplam proteaz aktivitesi, Yüksek sıcaklık, 20 S proteasome, Bacterial proteins, Microbial enzymes, Serine alkaline protease, Total protease activity, High temperature
- Yıl: 2003
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Biyoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Bu çalışmada thermophilik bir arkea olan Thermoplasma volcanium'dan sitoplazmik iki yeni serine proteaz enzimi saflaştırılmış ve karakterize edilmiştir. Birinci proteaz enzimi iyon değiştirici ve afinite kolon kromatografisi ile saflaştırılmış ve esas olarak substrat profili ve inhibasyon özelliklerine dayanılarak bir kimotripsin benzeri serin proteaz olarak tanımlanmıştır. Proteaz aktivitesinin varlığı tek bir bant olarak (35 kDa) jelatin-zimografisi ile analiz edilmiştir. Optimum sıcaklık, azocazein hidrolizi için 60oC ve N-Suc-Phe-pNA hidrolizi için 50oC bulunmuştur. Optimum enzim aktivitesi pH 6.0-8.0 aralığında gözlenmiş olup maksimum aktivite pH 7.0'de saptanmıştır. Saflaştırılan proteaz N-Suc-Phe-pNA substratı için Km ve Vmax değerleri sırası ile 2.2 mM ve 40 μmoles.min-1.ml-1 dir. Enzim aktivasyonu için en etkin iki değerlikli katyonlar 4 mM konsantrasyonunda Ca2+ ve Mg2+'dur. Çalışmanın ikinci kısmında, önemli düzeyde Tp. volcanium 20S proteazomu saflaştırılmış ve karakterize edilmiştir. Bu enzim kompleksi hücre içi özütünden 4 aşamadan sonra spesifik aktivitesi 19.1 U/mg olarak saflaştırılmıştır. SDS-PAGE analizi yaklaşık moleküler ağırlıkları 26 kDa (α-alt ünitesi) ve 21.9 kDa (β-alt ünitesi) olan iki güçlü bandın varlığını göstermiştir. Tp. volcanium 20S proteazom, başlıca küçük chromogenic peptitlerin karboksil bölgesinde yer alan asidik Glu (postglutamil aktivite) ve hidrofobik Phe (kimotripsin benzeri aktivite) rezidülerinin peptit bağlarının kesilmesini katalize etmektedir. Tp. volcanium 20S proteazomunun kimotripsin benzeri aktivitesi bir kimotripsin spesifik serine proteaz inhibitörü olan kimostatin ile önemli ölçüde inaktive edilmiştir. Tripsin için substrat olan N-CBZArg kullanıldığında ise 20S proteasom aktivitesi TLCK tarafından güçlü bir şekilde inhibe edilmiştir. Tp. volcanium 20S proteazomun Ala-Ala-Phe-pNa hidrolizi için optimum sıcaklık 55o derecesi ve optimum pH derecesi 7.5'dur. Kimotriptik aktivite yüksek konsantrasyonlardaki (125-250 mM) Ca+2 and Mg2+ gibi metal iyonların varlığında belirgin olarak artmıştır.
Özet (Çeviri)
In this study, two novel cytoplasmic serine proteases were isolated and characterized from thermophilic archaea Thermoplasma volcanium. The first protease was purified by ion exchange and affinity chromatographies and identified as a chymotrypsin-like serine protease mainly based on its substrate profile and inhibition pattern. The presence of protease activity was analyzed by gelatin zymography which was detected as a single band (35 kDa). Optimum temperature was found to be 60oC for azocasein hydrolysis and 50oC for N-Suc-Phe-pNA hydrolysis. Optimum activity was observed in the pH range of 6.0-8.0 with a maximum value at pH 7.0. The Km and Vmax values for the purified protease were calculated to be 2.2 mM and 40 μmoles of p-nitroanilide released min-1.ml-1, respectively, for N-Suc-Phe-PNA assubstrate. Ca2+ and Mg2+ at 4 mM concentrations were the most effective divalentcations in activating the enzyme. In the second stage of this study, 20S proteasome of Tp. volcanium with substantialchymotrypsin-like activity was purified and characterized. This enzyme complex was purified with 19.1 U/mg specific activities from cell free extract by a four-step procedure. SDS-PAGE analysis revealed two strong bands with relative molecular masses of 26 kDa (α-subunit) and 21.9 kDa (β-subunit). Tp. volcanium 20S proteasome predominantly catalyzed cleavage of peptide bonds carboxyl to the acidic residue Glu (postglutamyl activity) and the hydrophobic residue Phe (chymotrypsin-like activity) in short chromogenic peptides. Low-level hydrolyzing activity was also detected carboxyl to basic residue Arg (trypsin-like activity). Chymotrypsin-like activity of Tp. volcanium 20S proteasome was significantly inhibited by chymotrypsin specific serine protease inhibitor chymostatin. When NCBZ- Arg was used which is a substrate for trypsin, 20S proteasome was strongly inhibited by TLCK. The optimum temperature for Ala-Ala-Phe-pNA hydrolysis by the Tp. volcanium 20S proteasome was 55oC and the optimum pH was 7.5. The chymotryptic activity was significantly enhanced by divalent cations such as Ca+2 and Mg2+ at high concentrations, i.e. 125-250 mM.
Benzer Tezler
- Purification and characterization of cytoplasmic and proteasome associated chymotrypsin-like proteases from Thermoplasma volcanium
Thermoplasma volcanium`dan sitoplazmik ve proteazomal kimotripsin benzeri proteazların saflaştırılması ve karakterizasyonu
İNCİ ÖZDEMİR
Doktora
İngilizce
2003
BiyolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. SEMRA KOCABIYIK
- Beyin ve beyin zarından sitozolik ve nonsitozolik karbonik anhidraz enzimlerinin izolasyonu ve karakterizasyonu
Purification and characterization of cytoplasmic and noncytoplasmic carbonic anhydrases from brain and brain membrane
FATMA COŞKUN
- Partial purification and characterization of sheep liver xanthine oxidase
Başlık çevirisi yok
HAKAN GÖNÜL
Yüksek Lisans
İngilizce
1993
BiyolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MESUDE İŞCAN
- Expression, purification, and characterization of soluble recombinant TNFR1
Çözünür rekombinant TNFR1'in üretimi, saflaştırılması ve karakterizasyonu
DERYA HATİPOĞLU
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
- Expression, purification, and characterization of recombinant human IL-2
Rekombinant insan IL-2'nin ekspresyonu, saflaştırılması ve karakterizasyonu
BUSE AKGÜN
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
