Geri Dön

Detection of Legionella pneumophila using metal-organic framework-808-EDTA in electrochemical immunosensors

Elektrokimyasal immünosensörlerde metal-organik kafes-808-EDTA kullanılarak Legıonella pneumophila tespiti

  1. Tez No: 901089
  2. Yazar: CANAN BUSE ABDÜL
  3. Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ ABDULHALİM KILIÇ, DOÇ. DR. İLKE GÜROL
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyomühendislik, Biyoteknoloji, Bioengineering, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2024
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoteknoloji ve Genetik Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 57

Özet

Legionella pneumophila, Legionella cinsinin en belirgin patojenik türlerinden biridir ve hafif grip benzeri Pontiac ateşi veya daha şiddetli zatürre türü olan Lejyoner hastalığı olarak kategorize edilebilen Legionellosis hastalıklarına neden olmasıyla bilinir. Dahası, Legionella spp. epitel dokulardan geçerek kan dolaşımına yayılabilir ve kalp ve böbrekler gibi akciğer dışında diğer organlarda da komplikasyonlara neden olabilir ve çoklu organ yetmezliğine yol açabilir. Lejyonelloz kişiden kişiye yayılmasa da bulaşıcıdır ve L. pneumophila barındıran aerosollerin solunmasıyla bulaşabilir. Lejyonelloz için birincil risk grupları arasında 50 yaş üstü kişiler, sigara içenler ve kronik hastalığı olanlar yer alır. L.pneumophila salgınlarını önlemek için, su dağıtım tesislerini ve bina soğutma sistemlerini kontaminasyon açısından düzenli olarak izlemek ve kontrol etmek çok önemlidir. Lejyonelloz'un hızlı ilerlemesi nedeniyle, antibiyotik direncine yol açabilecek geniş spektrumlu antibiyotikler reçete edilmeden önce hastalığa neden olan spesifik patojenin belirlenmesi önemlidir. Ancak, gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu, enzim bağlantılı immünosorbent testi (ELISA), kültürleme veya idrar testleri gibi yaygın olarak kullanılan tespit yöntemleri saatler veya günler sürebilir ve de özel olarak Legionella testleri her zaman mevcut olmayabilir. Bu nedenle, uzun zaman almayan veya deneyimli bir teknisyen gerektirmeyen hızlı bir Legionella pneumophila biyosensörü geliştirmek çok önemlidir. Biyosensörler, çeşitli dönüştürücüler kullanarak karmaşık örneklerdeki belirli maddeleri tespit etmek için biyolojik moleküller kullanan analitik cihazlardır. Bu sensörler yalnızca bir maddenin varlığını tespit etmekle kalmaz, aynı zamanda sensörün biyolojik bileşeniyle biyokimyasal reaksiyonlar yoluyla konsantrasyonunu da belirleyebilir. Bu çok yönlü cihazlar, kontaminasyon için izleme sistemleri olarak teşhis, çevresel izleme, tarımsal değerlendirmeler teşhisten gıda kalite kontrolüne kadar pek çok çeşitli uygulama alanına sahiptir. Tıbbi uygulamalarda, yüksek seçicilik ve hassasiyet biyosensörlerin en önemli özellikleridir. Endüstriyel kullanım için, yüksek kararlılıkları ve yeniden kullanılabilirlikleri temel özelliklerdir. Biyosensörler ayrıca, kısa süreler içinde hızlı yanıt vererek analit konsantrasyonlarına bağlı olarak düşük tespit limitleri ve doğrusal sonuçlar sergiler. Biyosensörlerin bir diğer avantajı da taşınabilir olmalarıdır. Ancak, bu özellik bir sorun olabilir; taşınabilirlik çeşitli ortamlarda kullanılabilirliklerini artırırken, minyatür tasarımları genellikle işlevselleştirme ve tespit için sınırlı yüzey alanıyla sonuçlanır. Biyosensörler hem biyoreseptörlerine göre, enzim bazlı, nükleik asit bazlı, tüm hücre, antikor bazlı, hem de dönüştürücülerine göre, optik, kütle bazlı, elektrokimyasal olarak kategorize edilebilirler. Bir biyosensör türü olan immünosensörler, antikor moleküllerini biyotanıma elemanları olarak kullanır ve özellikle patojenler için oldukça spesifik tespit sağlar. COVID-19 salgını, bulaşıcı hastalıklar için hızlı tespitin önemini ortaya çıkardı. Bulaşıcı patojenler için biyosensörler geliştirmek, epidemiyolojik nedenlerle hastalıkların yayılmasını ve şiddetini izlemek için oldukça önemlidir. Bu tür biyosensörler yalnızca tıbbi teşhislerde değil, aynı zamanda Legionella pneumophila kontaminasyonunu Lejyonelloz hastalıları salgınları meydana gelmeden önce tespit etmek için endüstriyel izleme sistemlerinde de kullanılabilir. Elektrokimyasal sensörler, analit ve biyoreseptör arasındaki, sensörün elektrodunda meydana gelen reaksiyonlar sırasında akım veya potansiyeldeki değişiklikleri ölçer. Reaksiyon yoğunluğu ve elektron transferlerinden elde edilen veriler, belirli analitler için hem niceliksel hem de nitel sinyallere dönüştürülebilir. Bu biyosensörler, yüksek özgüllük, hassasiyet ve yeniden kullanılabilirliğe sahip daha uygun fiyatlı ve basit bir yöntem olarak sunulabilirler. Elektrokimyasal biyosensörlerden elde edilen veriler, uygulanan yönteme göre değişir. Voltammetrik sensörler, elektroda değişen potansiyeller uygulayarak ve her potansiyelde ortaya çıkan akımı ölçerek analiti tespit eder. Döngüsel voltammetri, özellikle redoks reaksiyonlarının geri dönüşümlülüğünü araştırmak için elektrokimya uygulamalarında en yaygın kullanılan güçlü tekniklerden biridir. Biyosensörlerin geliştirilmesi sırasında bazı önemli faktörler mevcuttur. Elektrot yüzey modifikasyonu, hassas ve spesifik biyosensörler geliştirmede kritik bir faktördür. Reaksiyondaki değişiklikler elektroda yakın mesafede olması durumunda tespit edilebildiğinden, elektrot yüzey modifikasyonları elektrokimyasal biyosensörlerin seçiciliği ve hassasiyetinde önemli bir rol oynar. Uygun yüzey modifikasyonu, hem biyoreseptörlerin başarılı bir şekilde yüzeye bağlanmasında hem de spesifik olmayan bağlanmaları en aza indirerek düşük bir gürültü-sinyal oranı elde edilmesinde önemlidir. Biyotanıma elemanlarını yüzeye sabitleyerek sensör yüzeylerini modifiye etmek için çeşitli yöntemler mevcut olsa da, kendiliğinden oluşan tek katmanlar (SAM'ler), yeniden kullanılabilir ve uzun ömürlü biyosensörler oluşturmak için en yaygın kullanılan tekniktir. Sinyal amplifikasyonu, başarılı biyosensör geliştirmede bir diğer önemli adımdır. Sensör elektrotlarının sınırlı yüzey alanı nedeniyle, sinyalleri kayıpsız başarılı bir şekilde ölçmek esastır. Ek olarak, minimal analit konsantrasyonlarını tespit etmek, hem tıbbi hem de endüstriyel uygulamalarda biyosensörlerin geliştirilmesi ve entegrasyonu için de önemlidir. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, sinyali arttırıcı moleküller, işaretli molekülleri bağlamak için yüzey alanını artırmak için kullanılır ve böylece daha düşük analit konsantrasyonlarının tespitini geliştirilir. Nanopartiküller bu amaç için yaygın olarak kullanılır ve yüksek iletkenlikleri ve optik özellikleri nedeniyle en çok tercih edilenler altın nanopartikülleridir. Gümüş ve manyetik nanopartiküller de tespit ve sinyal arttırma için yaygın olarak kullanılır. Metal-organik kafes yapıları (MOF'lar), gaz depolama, adsorpsiyon ve ayırma gibi çeşitli uygulamalara sahip yeni bir gözenekli malzeme sınıfını temsil ederler. Yüksek gözeneklilikleri, arttırılmış yüzey alanları ve özelleştirilebilirlikleri nedeniyle MOF'lar, kısıtlı yüzey alanına sahip sensörlerde yüzey alanı arttırma için ilgi görmeye başlamıştır. Bu tezde, sinyal arttırımı için horseradish peroksidaz (HRP) bağlı sekonder antikorlarla kaplanmış MOF-808-EDTA moleküllerinin kullanıldığı yeni bir yaklaşım kullanılmıştır. Bu çalışmanın amacı Legionella pneumophila'nın hızlı tespiti için oldukça hassas ve spesifik bir biyosensör geliştirmektir. Tür içindeki en patojenik serogrup olan Legionella pneumophila serogrup 1'e özgü antikorlar kullanılarak ELISA tabanlı bir elektrokimyasal immünosensör geliştirildi. İmmünosensör tasarımı, yakalama ve tespit için iki set birincil antikor ve ölçüm süreciyle uyumlu işaretli bir ikincil antikor gerektiren endirekt sandviç ELISA protokolüne dayanmaktadır. Sinyal üretimi için HRP ve TMB seçilmiş olup ve elde edilen biyokimyasal reaksiyon voltametrik bir sensör sistemi tarafından döngüsel voltametrik ölçüm ile tespit edilmiştir. Biyosensör tasarım süreci birkaç adımdan oluşmaktadır: 11-merkaptoundekanoik asit ve 6-merkapto-1-heksanol kullanılarak altın elektrot yüzeyinde kendiliğinden oluşan bir tek katman (SAM) oluşturulması; yakalama antikorlarının EDC ve NHS kullanılarak SAM'e bağlanması; spesifik olmayan bağlanmayı önlemek ve stabiliteyi artırmak için etanolamin ve sığır serum albümini (BSA) ile bloke edilmesi; standart bir eğri elde etmek için çeşitli konsantrasyonlarda Legionella pneumophila kültürlerinin uygulanması; tespit antikorlarının ve HRP bağlı sekonder antikor kaplı MOF-808-EDTA çözeltilerinin eklenmesi; elektrokimyasal ölçümlerden hemen önce TMB çözeltisinin uygulanması; döngüsel voltametri ölçümleri -1 ile 1 volt arasında 50 milivolt/saniye tarama hızıyla alınmıştır. Çalışma, endirekt sandviç ELISA tabanlı bir immünosensör protokolü uygularken L. pneumophila içeren örneklerden tespit sinyallerini artırmak için metal-organik kafes yapıları kullanmayı amaçlamıştır. 10^-1 ila 10^6 koloni oluşturan birim (CFU)/ml konsantrasyon aralığında L. pneumophila'yı tespit etmek için MOF-808-EDTA'nın sinyal arttırıcı bir molekül olarak kullanılması başarı ile gösterilmiştir. Tespit sınırı (LOD) 0.6314 CFU/ml olarak hesaplanmış ve kantifikasyon sınırı (LOQ) 2.1045 CFU/ml olarak belirlenmiştir. Sonuç olarak, bu çalışma, geniş yüzey alanları nedeniyle EDTA ile modifiye edilmiş MOF-808'in sinyal yükseltici moleküller olarak kullanılmasının, daha düşük L. pneumophila konsantrasyonlarında tespiti iyileştirdiğini göstermiştir. L. pneumophila salgınlarıyla ilgili mevcut literatür ve yasal düzenlemelerle karşılaştırıldığında, tasarlanan biyosensör, sırasıyla 0.6314 CFU/ml ve 2.1045 CFU/ml olarak hesaplanan en düşük tespit ve kantifikasyon sınırlarından birini göstermiştir. Bu sonuçlar, bu biyosensörün çeşitli ortamlarda L. pneumophila'nın hızlı ve hassas tespiti için değerli bir araç olabileceğini düşündürmektedir.

Özet (Çeviri)

Legionella pneumophila is one of the most prominent pathogenic species of the Legionella genus, known for causing Legionellosis diseases, which can be categorized as either Pontiac fever or the more severe, Legionnaires' disease. While Legionellosis cannot spread from person to person, it is communicable and can be transmitted by inhaling aerosols contaminated with L. pneumophila. To prevent L.pneumophila outbreaks, it is crucial to regularly monitor and control water distribution plants and building cooling systems for contamination. Due to the rapid progression of Legionellosis, it is essential to identify the specific pathogen causing the disease before prescribing broad-spectrum antibiotics, which may lead to antibiotic resistance. However, commonly used detection methods such as real-time polymerase chain reaction (PCR), enzyme-linked ımmunosorbent assay (ELISA), culturing, or urinary antigen tests can take hours to days, and additional Legionella tests may not always be available. Therefore, developing a rapid Legionella pneumophila biosensor that does not require extensive time or an experienced technician is crucial. Biosensors are analytical devices that use biological molecules to detect specific substances in complex samples using various transducers. These sensors can not only detect the presence of a substance but also determine its concentration through biochemical reactions with the biological component of the sensor. Immunosensors, a type of biosensor, use antibody molecules as biorecognition elements, providing highly specific detection, especially for pathogens. The COVID-19 pandemic has highlighted the importance of rapid detection for contagious diseases. Developing biosensors for infectious pathogens is crucial for tracking the spread and severity of diseases for epidemiological reasons. Such biosensors could be used not only in medical diagnostics but also in industrial tracking systems to detect Legionella pneumophila contamination before Legionnaires' disease outbreaks occur. When designing a biosensor, maximizing the signal detected by the transducer is crucial, given the limited surface area of screen-printed sensors. Nanoparticles (NPs) with signaling properties are often used for this purpose. In this study, a novel approach using MOF-808-EDTA molecules covered with horseradish peroxidase (HRP)-linked secondary antibodies was employed for signal amplification. The aim of this study was to develop a highly sensitive and specific biosensor for the rapid detection of Legionella pneumophila. An ELISA-based electrochemical immunosensor was developed using antibodies specific for Legionella pneumophila serogroup 1, the most pathogenic serogroup within the species. The immunosensor design was based on an indirect sandwich ELISA protocol, requiring two sets of primary antibodies for capture and detection, and a labeled secondary antibody compatible with the measurement process. HRP and TMB were chosen for signal generation with the resulting biochemical reaction detected by a voltammetric sensor system. The biosensor design process involved several steps: Formation of a self-assembled monolayer (SAM) on the gold electrode surface using 11-mercaptoundecanoic acid and 6-mercapto-1-hexanol; cross-linking of capture antibodies to the SAM using EDC and NHS; blocking with ethanolamine and bovine serum albumin (BSA) to prevent non-specific binding and increase stability; application of Legionella pneumophila cultures at various concentrations to obtain a standard curve; addition of detection antibodies and HRP-linked secondary antibody-covered MOF-808-EDTA solutions; application of TMB solution immediately before electrochemical measurements. Cyclic voltammetry measurements were taken between -1 and 1 volt with a 50 millivolt/second scan rate. The study aimed to use metal-organic frameworks to increase detection signals from L. pneumophila-containing samples while applying an indirect sandwich ELISA-based immunosensor protocol. The success of using MOF-808-EDTA as a signal-amplifying molecule for detecting L. pneumophila within a concentration range of 10^-1 to 10^6 CFU/mL was demonstrated. The limit of detection (LOD) was calculated as 0.6314 CFU/mL , and the limit of quantification (LOQ) was 2.1045 CFU/mL. In conclusion, this study demonstrated that the use of EDTA-modified MOF-808 as signal-amplifying molecules, due to their large surface area, improved detection at lower concentrations of L. pneumophila. Compared to existing literature and legal regulations concerning L. pneumophila outbreaks, the designed biosensor displayed one of the lowest detection and quantification limits, calculated as 0.6314 CFU/mL and 2.1045 CFU/mL, respectively. These results suggest that this biosensor could be a valuable tool for rapid and sensitive detection of L. pneumophila in various settings.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    499459

    Legionella pneumophila'nın yüzeyde zenginleştirilmiş raman saçılmasına dayalı hızlı, hassas ve doğru tanısı için yöntem geliştirilmesi

    Development of a method for fast, sensitive and accurate detection of Legionella pneumophila based on surface enhanced raman scattering

    ÖKKEŞ ÇELİK

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2018

    KimyaGaziantep Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. MEHMET KAHRAMAN

    DOÇ. DR. İBRAHİM HALİL KILIÇ

  2. Tez No

    129828

    Diş hekimi muayenehanesinde legionella taraması

    Detection of legionella in dental office

    EMRE BODRUMLU

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2003

    Diş HekimliğiGazi Üniversitesi

    Diş Hastalıkları ve Tedavisi Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. AYDIN BAYRAKTAR

  3. Tez No

    80093

    Alt solunum yolu enfeksiyonlu kişilerin idrarında enzyme immunoassay yöntemi ile ligionella pneumophila serogrup 1 antijenlerinin araştırılması

    A Study of legionella pneumophila serogroup 1 antigen in detection the urine of lower respiratory tract infected patients using enzyme immuno assay method

    HALE HOŞBAHAR

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    1997

    MikrobiyolojiAnkara Üniversitesi

    Farmasötik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. NEJAT UÇARTÜRK

  4. Tez No

    363918

    Farklı çevresel koşullara maruz bırakılan legionella pneumophila bakterilerinin tespitinde uygun yöntemlerin belirlenmesi

    Identification of proper methods to determine legionella pneumophila bacteria exposed to different environmental conditions

    İPEK ADA

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2014

    Mikrobiyolojiİstanbul Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. AYTEN ERDEM

  5. Tez No

    350334

    Edirne ilindeki çevresel sularda kirlilik indikatörü mikroorganizmaların ve yeni çıkan bakteriyel patojenlerin moleküler yöntemlerle saptanması

    Detection of pollution indicator microorganisms and emerging bacterial pathogens by using molecular methods in environmental water samples from Edirne region

    MÜJDAT ÖZGÜR

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2013

    MikrobiyolojiTrakya Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ECE ŞEN

Geri Dön