Geri Dön

Mass spectrometry based approaches for monoclonal antibody characterization and target discovery in endoplasmic reticulum associated protein degradation (ERAD) pathway

Monoklonal antikor karakterizasyonu ve endoplazmik retikulum ilişkili protein yıkım (ERAD) yolağında hedef keşfi için kütle spektrometrisi temelli yaklaşımlar

  1. Tez No: 961039
  2. Yazar: BARAN DİNGİLOĞLU
  3. Danışmanlar: PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyokimya, Biyoteknoloji, Biochemistry, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2025
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 105

Özet

Bu tez, modern biyoteknoloji ve hücre biyolojisindeki iki kritik zorluğa çözüm bulmak amacıyla gelişmiş kütle spektrometrisi tabanlı yaklaşımların uygulanmasına yönelik kapsamlı bir araştırmayı sunmaktadır: terapötik monoklonal antikorların karakterizasyonu ve endoplazmik retikulumla ilişkili yıkım (ERAD) yolundaki yeni protein hedeflerinin tanımlanması. Sofistike analitik tekniklerin hücresel biyoloji yaklaşımlarıyla entegrasyonu yoluyla, bu araştırma hem biyofarmasötik geliştirme hem de temel hücresel protein kalite kontrol mekanizmalarına dair bilgimizi genişletmektedir. Araştırma, biyolojik araştırmalarda kütle spektrometrisinin çok yönlülüğünü ve gücünü birlikte gösteren iki tamamlayıcı amaç etrafında yapılandırılmıştır. Birinci amaç, özellikle biyobenzer karakterizasyonuna vurgu yaparak monoklonal antikor Fab fragmanlarının yapısal ve fonksiyonel profillenmesi için yüksek çözünürlüklü analitik metodolojiler oluşturmaya odaklanmaktadır. İkinci amaç, hücresel protein homeostazisindeki yeni substratların ve düzenleyici mekanizmaların keşfine yol açan ERAD bileşenlerinin etkileşim ortamını aydınlatmak için proteomik analizle birleştirilmiş yakınlık bağlı biyotinilasyon tekniklerini kullanmaktadır. Bu araştırmanın ilk ana bileşeni, özellikle vasküler endotelyal büyüme faktörü A'yı (VEGF-A) hedefleyen insanlaştırılmış bir monoklonal antikor fragmanı olan ranibizumaba odaklanarak, terapötik antikor geliştirmede sağlam analitik çerçevelere duyulan kritik ihtiyacı ele almaktadır. Bu terapötik, patolojik anjiyogenezde hassas moleküler müdahale yoluyla terapötik hedefleri görme stabilizasyonundan gerçek görme iyileşmesine dönüştürerek retina hastalığı tedavisinde devrim yaratan sofistike bir protein mühendisliği örneğini temsil etmektedir. Karakterizasyon, dört tamamlayıcı analitik tekniği içeren çok katmanlı bir kütle spektrometrisi platformu kullanmıştır: denatüre edici koşullar altında bozulmamış moleküler ağırlık belirleme, indirgenmiş antikor alt birimlerinin sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi profillemesi, ayrı ayrı ağır ve hafif zincirlerin dekonvolüte kütle analizi ve üç boyutlu yapısal karakterizasyon için iyon hareketliliği-kütle spektrometrisi. Bu kapsamlı yaklaşım, referans ve biyobenzer antikor ürünleri arasında çoklu yapısal seviyelerde biyobenzerliği kurmak için tasarlanmıştır. Analitik sonuçlar, ölçülen tüm parametrelerde biyobenzer ve referans antikorlar arasında dikkate değer bir uyum göstermiştir. Nativ kütle spektrometrisi, neredeyse üst üste binen yük durumu spektrumların ve moleküler ağırlık dağılımlarını ortaya koyarak genel moleküler mimarinin korunduğunu göstermiştir. Kimyasal olarak indirgenmiş antikor zincirlerinin ters fazlı sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi analizi, her iki ürün arasında tutarlı kromatografik özellikler ortaya koymuştur. Hafif zincir ve ağır zincir bileşenleri, her iki numune için aynı elüsyon motifleri ve alıkonma sürelerini göstererek, ayrı ayrı polipeptit alt birimlerinin eşdeğer hidrofobik özelliklerini ve kromatografik davranışını doğrulamıştır. Kütle dekonvolüsyonu, alt birim eşdeğerliğinin kantitatif doğrulamasını sağlamış, ağır zincir ve hafif zincir kütleleri hem biyobenzer hem de referans ürünler için aynı değerleri göstermiştir. İyon mobilite-kütle spektrometrisi, gaz fazı konformasyonel analizi yoluyla daha yüksek dereceli yapısal korunmanın değerlendirilmesini sağlamıştır. Yük durumu bağımlı mobilite süresi ölçümleri ve kütle seçilmiş hareketlilik profilleri, biyobenzer ve referans numuneler arasında aynı varış süresi dağılımlarını vermiştir. Yük durumları ve analitik tekrarlar boyunca mobilite süresi tutarlılığı, eşdeğer üç boyutlu benzer motifler göstermiş ve biyobenzer üretiminin konformasyonel bozulmalara veya yapısal istikrarsızlaşmaya neden olmadığını doğrulamıştır. İkinci ana araştırma bileşeni, ERAD sistemi içindeki etkileşim ağlarını sistematik olarak haritalamak için kütle spektrometrisi ile birleştirilmiş yakınlık bağlı biyotinilasyonu (BioID2) kullanmıştır. Bu yaklaşım, protein yıkımı sırasında bağlanma ve salınımın dinamik doğası nedeniyle ERAD substrat işlemenin karakteristik özelliği olan geçici etkileşimleri yakalayamayan geleneksel ko-immünopresipitasyon yöntemlerinin sınırlamalarının üstesinden gelmek için tasarlanmıştır. Anahtar ERAD mekanizma bileşenlerini hedefleyen sofistike üç noktalı BioID2 sistemi geliştirilmiştir: C-terminal biyotin ligazlı tam uzunlukta Derlin-1, ligazı ER lümenine yeniden yerleştiren kesik Derlin-1(1-170) ve hem N- hem de C-terminal biyotin ligaz füzyonlarına sahip p97/VCP. Bu stratejik konumlandırma, ER zarının her iki tarafından ve substrat ekstraksiyonunun ve işlemenin gerçekleştiği sitozolik bölmelerden etkileşen proteinleri yakalayarak ERAD işlem aşamalarının kapsamlı bir şekilde kapsanmasını sağlamıştır. Venn diyagramı analizi, her üç yapıda da tutarlı bir şekilde biyotinile edilmiş 12 proteini ortaya koymuş, tam uzunlukta ve kesik Derlin-1 yapıları arasında paylaşılan ek 47 protein ile hem korunmuş bir ERAD etkileşim çekirdeğini hem de alana özgü ilişkileri göstermiştir. Protein-protein etkileşim ağı analizi, kanonik ERAD bileşenlerinin yanı sıra mitokondriyal ve nükleer ilişkili proteinler de dahil olmak üzere paylaşılan etkileşimciler arasında yoğun bağlantılar göstermiştir. En önemli keşif, Prohibitin-2'nin (PHB2) yeni, kanonik olmayan bir ERAD substratı olarak tanımlanmasıydı. Geleneksel olarak mitokondriyal iç zarlarla ilişkili olan PHB2, her üç BioID2 yapısında da tutarlı bir şekilde ortaya çıkmış, bu da tesadüfi etkileşimlerden ziyade gerçek substrat-mekanizma ilişkilerini düşündürmüştür. Bu bulgu, öncelikle ER ortamında sentezlenen ve yanlış katlanan proteinlere odaklanan geleneksel ERAD modellerinden farklı bir yaklaşımdır. Sikloheksimid takip deneyleri yoluyla fonksiyonel doğrulama, MCF-7 hücrelerinde hızlı, zamana bağlı PHB2 yıkımını göstermiş, protein seviyeleri protein sentezi inhibisyonundan sonraki 6 saat içinde %25'in altına düşmüştür. Proteazom inhibisyonunu takiben immünopresipitasyon çalışmaları, yüksek moleküler ağırlıklı ubikuitin konjüge PHB2 türlerinin zamana bağlı birikimini ortaya koymuş, ERAD substrat davranışıyla tutarlı ubikuitin aracılı hedeflemeyi doğrulamıştır. Bununla birlikte, PHB2 yıkımı, proteazom inhibitörü (MG132) veya p97/VCP inhibitörü (CB5083) tedavisi ile sadece kısmen stabilize edilmiş, bu da ek yıkım yollarının – potansiyel olarak lizozomal veya otofajik mekanizmaların – devrine de katkıda bulunabileceğini göstermektedir. Bu eksik stabilizasyon, PHB2'yi klasik ERAD substratlarından ayırır ve daha geniş hücresel protein kalite kontrol ortamında substrata özgü yönlendirmeyi düşündürür. Belki de PHB2 bulgularının en ilgi çekici yönü, ER-SURF (ER-mitokondri protein transferi) yolu ile bariz bağlantısıydı. GFP etiketli PHB2'nin canlı hücre görüntülemesi, protein sentezi inhibisyonunu takiben mitokondriyal ko-lokalizasyonda zamana bağlı artışlar ortaya koymuş, pasif yeniden dağılımdan ziyade aktif yeniden lokalizasyonu düşündürmüştür. Bu dinamik yeniden dağılım paterni, mitokondriyal öncü proteinlerin başlangıçta ER yüzeyine hedeflendiği ve ardından özel temas bölgeleri yoluyla mitokondriye transfer edildiği bir mekanizma olan ER-SURF yolu ile tutarlıdır. Veriler, ER-SURF yolunun ikili işlevlere hizmet edebileceğini düşündürmektedir: sadece mitokondriyal öncü proteinleri sentez yerlerinden son varış noktalarına ulaştırmakla kalmayıp, aynı zamanda hasarlı veya fazla PHB2'yi mitokondriden ERAD aracılı yıkım için ER'ye geri yönlendiren bir kalite kontrol mekanizması olarak da işlev görmektedir. Bu çift yönlü trafik, çoklu hücresel bölmeler arasında protein homeostazisini koordine eden sofistike bir organeller arası iletişim sistemini temsil edecektir. İmmünositokimya analizi, MCF-7 hücrelerinde PHB2 ile BioID2 etiketli ERAD bileşenleri (Derlin-1, kesik Derlin-1 ve p97/VCP) arasında güçlü bir ko-lokalizasyon göstermiş, en güçlü sinyal ER lümenal yüzünü hedefleyen kesik Derlin-1 yapısı ile gözlenmiştir. Bu bulgu, PHB2'nin ERAD sistemine lümenal veya zara gömülü taraftan, birincil mitokondriyal ilişkisine rağmen muhtemelen ERAD-L kolu aracılığıyla katıldığını düşündürmektedir. Araştırma, hastalık mekanizmalarına önemli bilgiler sağlayan PHB2 yıkım modellerinde hücre tipi özgüllüğünü ortaya çıkarmıştır. PHB2, östrojen reseptörü pozitif hücre hatlarında (MCF-7, BT-474) ve tümörijenik olmayan meme epitel hücrelerinde (MCF-12A) etkili bir şekilde yıkıma uğrarken, üçlü negatif MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinde dikkate değer ölçüde stabil kalmıştır. Bu farklı düzenleme, PHB2 devrinin hormonal sinyalleşme veya malign transformasyon sırasında değişen spesifik ERAD mekanizma bileşenleri tarafından kontrol edilebileceğini düşündürmektedir. PHB2'nin MDA-MB-231 hücrelerinde yıkıma karşı direnci, kanser gelişimi sırasında meydana gelen protein kalite kontrol sistemlerindeki daha geniş değişiklikleri yansıtabilir. Üçlü negatif meme kanserleri, agresif büyüme modelleri, metabolik yeniden programlama ve değişmiş hücresel stres tepkileri ile karakterizedir. Bu hücrelerde PHB2'nin stabilizasyonu, değişmiş mitokondriyal fonksiyona ve enerji metabolizmasına katkıda bulunabilir, potansiyel olarak bu tümörlerin agresif fenotipini desteklerken yeni terapötik hedefi sunabilir. PHB2'nin kanonik olmayan bir ERAD substratı olarak tanımlanması, hücresel protein kalite kontrolüne dair anlayışımızı geleneksel ER'de yerleşik proteinlerin ötesine genişletmektedir. Bu keşif, ERAD'ın sofistike organeller arası iletişim sistemleri aracılığıyla çoklu organeller arasında protein homeostazisini koordine eden daha geniş bir hücresel düzenleyici mekanizma olarak işlev gördüğünü düşündürmektedir. Gözlenen hücre tipine özgü düzenlemenin, kanser hücrelerinin normal protein kalite kontrol sistemlerinden nasıl kaçtığını anlamak için önemli etkileri vardır.

Özet (Çeviri)

This thesis presents a comprehensive investigation into the application of advanced mass spectrometry-based approaches to address two critical challenges in modern biotechnology and cellular biology: the characterization of therapeutic monoclonal antibodies and the identification of novel protein targets within the endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) pathway. Through the integration of sophisticated analytical techniques with cellular biology approaches, this research advances our understanding of both biopharmaceutical development and fundamental cellular protein quality control mechanisms. The research is structured around two complementary objectives that together demonstrate the versatility and power of mass spectrometry in biological research. The first objective focuses on establishing high-resolution analytical methodologies for the structural and functional profiling of monoclonal antibody Fab fragments, with particular emphasis on biosimilar characterization. The second objective employs proximity-dependent biotinylation techniques coupled with proteomic analysis to elucidate the interaction landscape of ERAD components, leading to the discovery of novel substrates and regulatory mechanisms in cellular protein homeostasis. The first major component of this research addresses the critical need for robust analytical frameworks in therapeutic antibody development, specifically focusing on ranibizumab, a humanized monoclonal antibody fragment targeting vascular endothelial growth factor A (VEGF-A). This therapeutic represents a sophisticated example of protein engineering that has revolutionized retinal disease treatment by transforming therapeutic goals from vision stabilization to actual visual improvement through precise molecular intervention in pathological angiogenesis. The characterization employed a multi-tiered mass spectrometry platform comprising four complementary analytical techniques: intact molecular weight determination under denaturing conditions, liquid chromatography-mass spectrometry profiling of reduced antibody subunits, deconvoluted mass analysis of individual heavy and light chains, and ion mobility-mass spectrometry for three-dimensional structural characterization. This comprehensive approach was designed to establish biosimilarity between reference and biosimilar antibody products across multiple structural levels. The analytical results demonstrated remarkable concordance between biosimilar and reference antibodies across all measured parameters. Intact mass spectrometry revealed virtually superimposable charge state envelope patterns and molecular weight distributions, indicating preservation of overall molecular architecture. Mass-to-charge ratio alignment across multiple charge states confirmed equivalent intact molecular composition, establishing biosimilarity at the global structural level. Reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry analysis of chemically reduced antibody chains revealed consistent chromatographic properties between both products. Light chain and heavy chain components showed identical elution patterns and retention times for both samples, confirming equivalent hydrophobic characteristics and chromatographic behavior of individual polypeptide subunits. Mass spectral deconvolution provided quantitative validation of subunit equivalence, with heavy chain and light chain masses showing identical values for both the biosimilar and reference products. Ion mobility-mass spectrometry enabled evaluation of higher-order structural preservation through gas-phase conformational analysis. Charge-state resolved drift time measurements and mass-selected mobility profiles yielded identical arrival time distributions between biosimilar and reference samples. Drift time consistency across charge states and analytical replicates indicated equivalent three-dimensional folding patterns, confirming that biosimilar production did not introduce conformational perturbations or structural destabilization. The second major research component employed proximity-dependent biotinylation (BioID2) coupled with mass spectrometry to systematically map interaction networks within the ERAD system. This approach was designed to overcome the limitations of traditional co-immunoprecipitation methods, which fail to capture the transient interactions characteristic of ERAD substrate processing due to the dynamic nature of binding and release during protein degradation. A sophisticated triple-point BioID2 system was developed targeting key ERAD machinery components: full-length Derlin-1 with C-terminal biotin ligase, truncated Derlin-1(1-170) that relocates the ligase to the ER lumen, and p97/VCP with both N- and C-terminal biotin ligase fusions. This strategic positioning enabled comprehensive coverage of ERAD process stages, capturing proteins interacting from both sides of the ER membrane and in cytosolic compartments where substrate extraction and processing occur. Venn diagram analysis revealed 12 proteins consistently biotinylated across all three constructs, with an additional 47 proteins shared between full-length and truncated Derlin-1 constructs, indicating both a conserved ERAD interaction core and domain-specific associations. Protein-protein interaction network analysis demonstrated dense connections among shared interactors, including canonical ERAD components as well as mitochondrial and nuclear-associated proteins. The most significant discovery was the identification of Prohibitin-2 (PHB2) as a novel, non-canonical ERAD substrate. PHB2, traditionally associated with mitochondrial inner membranes, appeared consistently across all three BioID2 constructs, suggesting genuine substrate-machinery relationships rather than coincidental interactions. This finding challenges conventional ERAD models that focus primarily on proteins synthesized and misfolded within the ER environment. Functional validation through cycloheximide chase assays demonstrated rapid, time-dependent PHB2 degradation in MCF-7 cells, with protein levels declining to less than 25% within 6 hours of protein synthesis inhibition. Immunoprecipitation studies following proteasome inhibition revealed time-dependent accumulation of high molecular weight ubiquitin-conjugated PHB2 species, confirming ubiquitin-mediated targeting consistent with ERAD substrate behavior. However, PHB2 degradation was only partially stabilized by proteasome inhibitor (MG132) or p97/VCP inhibitor (CB5083) treatment, indicating that additional degradation pathways—potentially lysosomal or autophagic mechanisms—may also contribute to its turnover. This incomplete stabilization distinguishes PHB2 from classical ERAD substrates and suggests substrate-specific routing within the broader cellular protein quality control landscape. Perhaps the most intriguing aspect of the PHB2 findings was the apparent connection to the ER-SURF (ER-to-mitochondria protein transfer) pathway. Live-cell imaging of GFP-tagged PHB2 revealed time-dependent increases in mitochondrial colocalization following protein synthesis inhibition, suggesting active relocalization rather than passive redistribution. This dynamic redistribution pattern is consistent with the ER-SURF pathway, a mechanism by which mitochondrial precursor proteins are initially targeted to the ER surface before transfer to mitochondria via specialized contact sites. The data suggest that the ER-SURF pathway may serve dual functions: not only delivering mitochondrial precursor proteins from their synthesis site to final destination, but also functioning as a quality control mechanism that routes damaged or surplus PHB2 from mitochondria back to the ER for ERAD-mediated degradation. This bidirectional traffic would represent a sophisticated inter-organelle communication system coordinating protein homeostasis across multiple cellular compartments. Immunocytochemistry analysis demonstrated robust colocalization between PHB2 and BioID2-tagged ERAD components (Derlin-1, truncated Derlin-1, and p97/VCP) in MCF-7 cells, with the strongest signal observed with the truncated Derlin-1 construct targeting the ER lumenal face. This finding suggests that PHB2 engages the ERAD system from the luminal or membrane-embedded side, possibly through the ERAD-L branch despite its primary mitochondrial association. The research revealed striking cell-type specificity in PHB2 degradation patterns that provides important insights into disease mechanisms. While PHB2 underwent efficient degradation in estrogen receptor-positive cell lines (MCF-7, BT-474) and non-tumorigenic mammary epithelial cells (MCF-12A), it remained remarkably stable in triple-negative MDA-MB-231 breast cancer cells. This differential regulation suggests that PHB2 turnover may be controlled by hormonal signaling or specific ERAD machinery components that are altered during malignant transformation. The resistance of PHB2 to degradation in MDA-MB-231 cells may reflect broader alterations in protein quality control systems that occur during cancer development. Triple-negative breast cancers are characterized by aggressive growth patterns, metabolic reprogramming, and altered cellular stress responses. The stabilization of PHB2 in these cells could contribute to altered mitochondrial function and energy metabolism, potentially supporting the aggressive phenotype of these tumors while offering new therapeutic vulnerabilities. The convergence of these two research components demonstrates the power of mass spectrometry-based approaches in addressing both practical therapeutic development needs and fundamental biological questions. The monoclonal antibody characterization work provides a robust analytical framework for biosimilar development and regulatory evaluation, while the ERAD pathway investigation reveals new complexity in cellular protein quality control systems. The identification of PHB2 as a non-canonical ERAD substrate expands our understanding of cellular protein quality control beyond traditional ER-resident proteins. This discovery suggests that ERAD functions as a broader cellular regulatory mechanism, coordinating protein homeostasis across multiple organelles through sophisticated inter-organelle communication systems. The cell-type specific regulation observed has important implications for understanding how cancer cells evade normal protein quality control systems.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    901600

    Proteomic approaches for the identification and quantification of clinically relevant biomarkers

    Klinik önem taşıyan biyobelirteçlerin belirlenmesi ve miktar tayini için proteomik yaklaşımlar

    MELTEM AŞICIOĞLU KÜÇÜK

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2024

    Biyokimyaİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER

    DR. MERVE ÖZTUĞ KILINÇ

  2. Tez No

    724201

    Development and structural determination of antiangiogenic recombinant antibody structures for cancer treatment

    Kanser tedavisine yönelik antianjiogenik rekombinant antikor yapılarının geliştirilmesi ve yapısal tayini

    MELİS DENİZCİ ÖNCÜ

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Biyomühendislikİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY

    DR. AYLİN ÖZDEMİR BAHADIR

  3. Tez No

    450549

    Biochemical and proteomic analyses of normal human astrocytes and glioblastoma

    Sağlıklı astrosit ve glioblastomaların biyokimyasal ve proteomik analizleri

    FİRDEVS CANSU ATILGAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    BiyokimyaYeditepe Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. HÜSEYİN ÇİMEN

  4. Tez No

    622453

    Mass spectrometry-based proteome analysis of Leishmania Major parasite in two clinical isolates which exhibit different impact on virulence

    Leishmania Major parazitinin farklı virülens etki gösteren iki klinik vakada kütle spektrometresine dayalı proteomik analizi

    NAZLI GÜVENÇ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2018

    Kimyaİzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü

    Kimya Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. TALAT YALÇIN

  5. Tez No

    465429

    Strategies for isolation of novel enzymes by using metagenomics approach

    Metagenomik yaklaşım kullanılarak yeni enzimlerin elde edilmesi

    HAVVA ESRA TÜTÜNCÜ

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. NEVİN GÜL-KARAGÜLER

Geri Dön