Transglutaminazın florojenik substratlarının ve yeni inhibitörlerinin karakterizasyonu
Characterization of fluorogenic substrates and new inhibitors of transglutaminase
- Tez No: 379840
- Danışmanlar: PROF. DR. YEŞİM YEŞİLOĞLU
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyokimya, Biochemistry
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2014
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Trakya Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Kimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 61
Özet
Transglutaminaz ailesinin bir üyesi olan doku Transglutaminazı (TG2, protein-glutamin gama-glutamiltransferaz 2, EC 2.3.2.13) hem fizyolojide hem patofizyolojide farklı roller almasıyla sonuçlanan birçok ilginç özellikliğe sahip, çoklu bölgeli bir enzimdir [1]. Görevlerinden bir tanesi proteine bağlı glutamin gruplarının Ca2+ bağımlı transamidasyon reaksiyonlarını katalizleyip, proteinin geri dönüşümsüz çapraz bağlanmasına yol açmaktadır. İnflamasyon, yara iyileşmesi, hücre göçü, anjiyogenez ve apoptozis [2] gibi birçok fizyolojik sürece katılmaktadır ve etki ettiği hastalık aralığı oldukça geniştir. Tümör patofizyolojisine etkisi hala şüpheli görünse de [3], malign hücrelerdeki artışı kanıtlanmıştır [4]. Son zamanlarda TG2'nin çeşitli hücresel fonksiyonlarının aydınlatılmasındaki gelişmelere rağmen, hala akıllarda bazı sorular kalmaktadır. Bu nedenle TG2'nin patolojik koşullardaki hem kanıtlanmış hem de hala bilinmeyen yönleri, enzimi hedef alan inhibitörlerin ve görüntüleme problarının geliştirilmesine ilgiyi arttırmaktadır[1]. Bu tez TG2 aktivitesini fluorosans bazlı (HTS) tayinle, fluorojenik sentetik substratlar kullanarak gerçekleştiren ve bu substratlarla ilişkili yeni inhibitörleri araştıran bir çalışmayı içermektedir. TG2 aktivitesini Gillet et al [5] tarafından tanımlanmış RW129/12 ile ve Dr. Reik Löser (Institute of Radiopharmaceutical Cancer Research, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf, Almanya) tarafından sağlanan RW130/12 substratları ile belirlemeye yönelik bir sürekli florometrik analiz, 96 kuyucuklu mikrotabaka okuyucuda gerçekleştirilmiştir. Akseptör substrat olarak aminoasetonitril kullanılmıştır. 7-hidroksikumarin (HC), 7-hidroksi-4-metil-kumarin (HMC), TG2 ile substratların ayrı ayrı etkileşimi doğrultusunda salınan reaksiyon ürünleridir. Var olan yöntemin validasyonuyla başlanan analizlerde proteinin belirtilen koşullarda çökelti oluşturduğu tespit edildi. Bunu gidermek amacıyla çözünürlüğü arttırmaya yönelik yöntemler uygulandı. Farklı çözücüler denenerek ve daha düşük substrat konsantrasyonlarında çalışılarak çökelmenin giderildiği optimum koşul belirlendi. TritonX-100 ve NMP kullanılsa bile az da olsa bir çökelme oluştuğu gözlendi, ayrıca TritonX-100 ve NMP'nin varlığının reaksiyon verimini azaltıcı etki gösterdiği tespit edildi. Optimum koşulun, var olan yöntemden farklı olarak, %10 (v/v) DMSO kullandığı ve RW130/12 substratının 5µM'ı geçmeyecek konsantrasyonlarında çalışılan koşullar olduğu belirlendi. Yapılan optimizasyonların ardından, TG2 inhibisyonu referans inhibitör iyodoasetamid ile valide edildi ve substratların inhibisyon analizlerine uyarlanabilirliği tespit edildi. RW131/12'nin substrat özelliği göstermezken, substratlarda bulunan ester kısmının (TG2 tarafından kırılan) burada amid bağıyla yer değiştirmesi nedeniyle inhibitör özelliği gösterdiği bulundu. Yine denenen inhibitörlerden RW144/12 RW145/12'nin inhibisyona yatkınlıkları tespit edildi. Ancak IC50 değerleri yapıların stabil olmadığı raporlandığından hesaplanmadı.
Özet (Çeviri)
Tissue transglutaminase (TG2; Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase 2, EC 2.3.2.13), member of the Transglutaminase family, is a multidomain enzyme with many interesting properties resulting in versatile roles in both physiology and pathophysiology [1]. One of its function is to catalyse the Ca2+-dependent transamidation of protein-bound glutamine residues (donor substrate) leading to an inter- and intramolecular irreversible crosslinking of proteins. It is involved in multiple physiological processes including inflammation, wound healing, cell migration, angiogenesis, and apoptosis [2] and it is implicated in a wide range of diseases. Its implication in the pathophysiology of tumours is still matter of debate [3], but upregulation of TGase-2 in malignant cells has been demonstrated [4]. Despite recent progress in unraveling the different cellular functions of TG2, several questions remain. Thus, Transglutaminase 2 features in both confirmed and some still ambiguous roles within pathological conditions, raising interest in developing inhibitors and imaging probes which target this enzyme [1]. This thesis contains a study of TG2 activity, using fluorescence based (high throughput enabled screening assay) determination of fluorogenic synthetic substrates and substrate-related new inhibitors' investigation. A continious fluorometric assay, to determine the activity of TG2 as described by Gillet et al [5], has been used in order to measure the activity of TG2. with RW129/12 and RW 130/12 as donor substrate provided by Dr. Reik Löser Institute of Radiopharmaceutical Cancer Research, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf, Germany. Aminoacetonitrile was used as acceptor substrate. 7-hydroxycoumarin and 7-hydroxy-4-methyl-coumarin are the products, respectively, which are released upon the interaction of TGase with the substrates During validation of the method, precipitation occured. In order to dissipate precipitation solubility it is needed to increase solubility in the assay mixture. With the help of using different solvents and lower substrate concentrations, optimum conditions were determined and precipitation was dissipated. Even using TritonX-100 and NMP was increased solubility, precipitation had still slightly occured, besides, it was observed that the presence of TritonX-100 and NMP inhibits the reaction. Optimum conditions different from the described method have been determined and measurements were performed in the presence of 10% (v/v) DMSO and 5 µM donor substrate. After the optimization of the conditions, inhibition of TG2 was validated with the literature-known inhibitor iodoacetamide and applicability of the substrates for TG2 inhibition assay was determined. Substrate-related molecules act as inhibitors were characterized. RW131/12 showed inhibiton characteristics rather than substrate property due to the replacement of the ester moiety (cleaved by TG2) by an amide bond. Inhibition tendency of RW144/12 and RW145/12 were determined according to the assay. However IC50 values have not been determined due to the structure's reported unstability.
Benzer Tezler
- Transglutaminazın süt proteinlerinin bazı işlevsel özelliklerinin değişimi üzerine etkisi ve yoğurt ve peynire uygulanabilirliği
The effect of transglutaminase on modification of some functional properties of milk proteins and its adaptability on yogurt and cheese
ZERRİN YÜKSEL
Doktora
Türkçe
2007
Gıda MühendisliğiHacettepe ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. YAŞAR KEMAL ERDEM
- Transglutaminazın chia müsilaj bazlı yenilebilir filmle kaplı tavuk nuggetları üzerine etkisi
The effect of transglutaminase on chicken nugget covered with chia mucilage-based edible film
İLKAY ÇELİK
Yüksek Lisans
Türkçe
2020
Gıda MühendisliğiSelçuk ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. CEMALETTİN SARIÇOBAN
- Mikrobiyal transglutaminazın deve ve inek sütü karışımından kefir üretiminde kullanımı ve bu enzimin kefirin bazı özellikleri üzerine etkisinin araştırılması
The use of microbial transglutaminase in the production of kefir produced with the mixture of camel and cow's milk and the investigation of the effect of this enzyme on some properties of kefir
SELİN AKBULUT TOPEL
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
Gıda MühendisliğiAydın Adnan Menderes ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ SELDA BULCA
- Süne zararına uğramış buğday ununun katkı maddeleri kullanılarak ekmeklik kalitesinin iyileştirilmesi
The improving bread quality of insect (eurygaster integriceps) damaged wheat flour by using additives
ENDER KARATEKİN
Yüksek Lisans
Türkçe
2008
Gıda MühendisliğiÇukurova ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. MEHMET SERTAÇ ÖZER
- Kazeinomakropeptidin jelleşmesinde pH ve transglutaminaz enziminin etkisi
Effects of pH and transglutaminase enzyme on gelation of caseinomacropeptide
ESRA KOCAMAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2016
Gıda Mühendisliğiİstanbul Teknik ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MERAL KILIÇ AKYILMAZ