Identification of novel inhibitors targeting putative dantrolene binding site for ryanodine receptor 2
Ryanodine reseptörü için dantrolene bağlanma bölgesi hedef alınarak yeni inhibitör tanımlama
- Tez No: 733489
- Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ SEFER BADAY
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyofizik, Biyoloji, Biophysics, Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2022
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Hesaplamalı Bilimler ve Mühendislik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Hesaplamalı Bilim ve Mühendislik Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 115
Özet
Ryanodine reseptörleri büyük (yaklı ̧s 20 MDa) homotetramer kalsiyum iyon kanallarıdır. Bu re ̧septörler kas hücrelerinde sarkoplazmik retikulum üzerinde t-kanalına yakın oryantasyonda bulunurlar. Bu reseptörler kas kasılıp gev ̧semesi olayında merkezi rolü üstlenmektedir. Bilinen 3 isoformu bulunuyor. Bunlardan RyR1 daha çok iskelet kaslarında, RyR2 ise kalp kasında ço ̆gunlukla bulunmaktadır. RyR3 ise daha çok nöronlarda görülmektedir. Bu isoformlar 70% oranında sekans benzerli ̆gi göstermektedir. Daha önceki çalı ̧smalarda, kalsiyum salınımı kalp ve iskelet kasları için iki ̧sekilde tanımlanmı ̧stır. Bunlarda RyR1 yani iskelet kaslarında hücre zarına gelen voltaj de ̆gi ̧simin etkisiyle kalsiyum voltaj kanalları aktifle ̧sir ve bu kanallar ise direk olarak RyR1 açılımasını tetikler. Bu sayede kalsiyum salınımı gerçekle ̧smi ̧s olur. RyR2 için ise bu salınımda kalsiyum voltaj nalları aktifle ̧stikten sonra hücreler arası sıvıda bulunan kalsiyumum hücre içine alınımı yapılır ve bu kalsiyum konsatrisyon artı ̧sı RyR2 aktifle ̧stirerek kalsiyum salınımı gerçekle ̧stirilir. Bu olaya kalsiyum uyaranlı kalsiyum salınımı denir. Her iki kanal açılıp kapanma olayı protein domainlerinin gövde kayması ̧seklinde gerçekle ̧sir. Bu salınım her hangi bir mutasyon veya uyaran ile bozuldu ̆gunda normal olmayan hücresel aktivitelere neden olmaktadır. Bu reseptörler üzerinde görülen 300 den fazla mutasyon kas hastalıkları ile ili ̧skilendirilmi ̧stir. Günümüzde RyR2 ile direk ili ̧skilendirilen ritim bozuklu ̆gu gibi bir çok kalp rahatsızlı ̆gı tanımlanmı ̧stır. Bu bozuklukların giderilmesi için çe ̧sitli ilaçlar öne sürülmü ̧stür. Dantrolen bunlardan bir tanesidir ve malign hipertermi için tek onaylanmı ̧s ilaçtır. Bu rahatsızlık RyR1 aktivetisinin bozuklu ̆gunda görülmektedir. Fakat yapılan çalı ̧smalarda dantrolenin RyR2 üzerinde de etkisinin oldu ̆gu görülmü ̧stür. Ayrıca, dantrolen için öne sürülen ba ̆glanma sekansı bütün Ryanodine reseptörleri için korunmu ̧s oldu ̆gu görülmü ̧stür. Fakat dantrolen kalp rahatsızlıkları için kullanılması için uygun bir ilaç de ̆gildir. Bu durumunun nedenini dantrolenin kötü bir su çözünmesi ve ek regülatörlere ihtiyaç duymasına ba ̆glanıyor (Magnezyum, FKBP ve kalmodulin gibi). Dantrolen ba ̆glanma sekansı daha önce önerilmi ̧s olmasına ra ̆gmen her hangi bir yapısal bilgi mevcut de ̆gil. Biz bu çalı ̧smada üç durumu elde etmeyi amaç edindik. 1) RyR2 için tam atom membrane komplex olu ̧sturmak, 2) dantrolenin ba ̆glanma pozunun tahmin edilmesi, ve 3) yeni ilaç molekül adaylarının tanımlanması. RyR2 daha önceden cryo-em kullanılarak çıkarılmı ̧s yapıları bulunmaktadır. Fakat, bu yapılardan bazı amino asit sekansının tamamen, bazılarının ise sadece ana zinciri bulunamamı ̧s ya da iyi bir ̧sekilde görüntülenememi ̧stir. RyR2 yapıları incelendi ̆ginde küçük sekans bölgelerinin yanında, büyük sekans bölgelerinin çözümlenmedi ̆gi görülmü ̧stür. Bu çalı ̧smada AlphaFold2 (AF2) ve trRosetta kullanarak RyR2 yapısı çıkarılmıstır. RyR2 yapı tahminleri parça parça olacak ̧sekilde tahmin edildi. Sonra bu model parçaları son bir modelde birle ̧stirildi. AF2 ve Cryo-EM modelleri incelendi ̆ginde özellikle HD2 domaininde yapısal farklar oldu ̆gu gözelemlendi ve bu durumun proteinin aktivasyonunda etkisi olabilece ̆gi öngörülmü ̧stür. Olu ̧sturulan model yapısının optimizasyonu 35ns MD simülasyon ile yapıldı. Literatürde dantrolen molekülünün Ryanodin reseptörleri üzerindeki ba ̆glanma bölgesi amino asit sekansı 590–609 kalıntıları RyR1 için, 601–620 kalıntıları RyR2 için olarak verilmi ̧s olsa da deneysel olarak 3-boyutlu yapısı bulunmamaktadır. Ryanodin reseptörünün dantrolen molekülü ile kompleks yapılarının potansiyel ba ̆glanma pozlarının tahmini ve simülasyonları için dantrolenin Ryanodin reseptörünün kenetlenme (docking) hesapları gerçekle ̧stirilmi ̧stir. Bunun için üç farklı program kullanılmı ̧stır. Bunlar Glide XP, AutoDock VINA ve LeDock programlarıdır. Yukarıda belirtilen model yapılarındaki de ̆gi ̧sikli ̆ge ek olarak bir di ̆ger yapısal model farklılı ̆gın dantrolene ba ̆glanma sekansına çok yakın bir bölgedeki amino asit sekansında oldu ̆gu gözlenmi ̧stir. Bu farklılıktan kaynaklı olu ̧sabilecek farklılıkları görebilmek için kenetlenme çalı ̧sması, yapı modellemesi sonuçlarından elde edilen iki farklı protein modeli üzerinde (AF2-temelli ve Cryo-EM-temelli) uygulandı. Ba ̆glanma sekansının tamamı farklı merkez ve büyüklükler ile olu ̧sturulan grid kutuları ile tarandı. Sonuç olarak dantrolen popülasyonu, a ̆gırlıklı olarak 6 alan tarafından olu ̧sturulan belirli bir lokastonda elde edildi. Yerle ̧stirme sonuçları arasında, afinite puanları ve poz benzerli ̆gi açısından be ̧s ba ̆glama pozu (kriyo-em için 3, AF2 modeli için 2) seçildi. Bu pozlar, poz ba ̆glama davranı ̧sını ele almak için 200ns MD simülasyonunda (298K, NPT) kullanıldı. Simülasyonlarda RyR2'den alınan kesilmi ̧s sistem kullanılmı ̧s ve yapıyı böldü ̆gümüz bölgelerde kısıtlamalar tanımlanmı ̧stır. 200ns'den sonra, dört dantrolen ba ̆glanma pozunun (her biri için 2) ba ̆glanma bölgesinde kaldı ̆gı ve dantrolen ba ̆glanma sekansı ile belirli bir etkile ̧simde oldu ̆gu görüldü. Ba ̆glanma pozlarının ba ̆glanma serbest enerjisini hesaplamak için MD yörüngeleri kullanılarak MMPBSA analizi yapıldı. Bunun yanı sıra, FKBP12.6 ba ̆glamasının dantrolen ba ̆glanmasındaki etkisinin ara ̧stırılması için tekrardan kenetlenme sonucunda elde edilen yapılar kullanıldı ve MMPBSA ile ba ̆glanma serbest enerjileri hesaplandı. MMPBSA sonuçlarıyla birlikte MD simülasyonlarının yapısal kümelenmesi sonuçları baz alındı ̆gında, belirli dantrolen oryantasyonunun, yakla ̧sık R606, E1649 ve L1650 kalıntılarına en yüksek ba ̆glanma kabiliyetini gösterdi ̆gi görüldü. Fakat, dantrolen ba ̆glanmasında AF2 model ve Cryo-EM model arasında anlamlı bir fark görülmedi. Bu çalı ̧sma dantrolene ba ̆glanmasını hesapsal yolla inceleyen ilk çalı ̧sma olup daha sonralarında bu konu üzerinde yapılacak olan çalı ̧smalarla dantrolen ba ̆glanması daha kapsamlı olarak incelenecektir. Bunlara ek olarak, yeni inhibitörlerin tanımlanması için dantrolen ba ̆glanmasının yo ̆gunlukta oldu ̆gu bölgeye odaklanıldı ve ZINC15 veri tabanından alınan 3.5 milyon molekül yüksek verimli bir tarama ile incelendi. Moleküller, moleküler a ̆gırlıklarına (%70 insan oral absorpsiyon durumuna göre, MD simülasyonları için en iyi 11 molekül seçildi ve 200ns MD simülasyonu Desmond kullanılarak moleküllerin ba ̆glanma davranı ̧slarının incelenmesi gerçekle ̧stirilmi ̧stir. Moleküllerin 7'si, dantrolen ba ̆glanma sekansı ile etkile ̧simlerini sürdürdü ̆gü görülmü ̧stür. Bunlar, RyR2 aktivitesini düzenleyebilecek adaylar olarak önerildi. Özellikle, iki molekül ba ̆glanma stabilitesinin çok yüksek olabilece ̆gi öngörüldü bu moleküllerin RMSD de ̆gerlerinin 1 ̊Â civarında oldu ̆gu görülmü ̧stür. Bu moleküllerin inhibasyon etkilerin deneysel i ̧sbirlikçilerimiz tarafından deneysel olarak test edilecektir.
Özet (Çeviri)
Ryanodine receptors (RyRs) are large (around 20 MDa) homotetrameric intracellular ion channels. RyRs are located in the membrane of the sarcoplasmic reticulum (SR). RyRs play a central role in the excitation-contraction coupling by regulating Ca2+ release from the SR to the cytosol. Three isoforms are sharing 70% sequence similarity; RyR1, RyR2 and RyR3 are predominantly expressed in skeletal, cardiac muscles and neurons, respectively. In all isoforms, the open and close state transition occurs by rigid-body shifts of domains that provide the overall breathing motion of the cytoplasmic region. Dysregulation of RyRs leads to abnormal cellular activity. More than 300 mutations have been associated with muscle and neuronal diseases. Today, there have been identified several heart diseases caused by aberrant RyR2 activity such as catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia, cardiomyopathies, and cardiac arrhythmias. This unwanted RyR2 activity can be modulated by drugs. Dantrolene is an approved muscle relaxant used for the treatment of malignant hyperthermia that occurs by dysregulation of RyR1. Previously, a dantrolene binding sequence was suggested, and this sequence is conserved for all RyRs. However, dantrolene has poor water solubility and dantrolene exerts its effect on RyR2 only in the presence of regulators such as Mg2+ and calmodulin. In addition to this, although the amino acids 590-609 in RyR1 (601-620 RyR2 equivalent) were identified as dantrolene binding sequences, dantrolene bound complex structure has not been elucidated yet. Here, we aimed three things; 1) modelling of full atom structure of RyR2 with membrane, 2) predicting dantrolene binding orientation and 3) identifying novel inhibitors targeted to the putative binding sequence of dantrolene to regulate RyR2 function. While most of the structure of RyR2 has been solved recently, some of the regions are still missing. To predict missing regions, we used trRosetta and AlphaFold2 which is a state-of-art deep-learning-based method for protein modelling. Each missing segment was modelled separately and combined at the end. The final model, then, was optimized by 35ns MD simulation. Subsequently, to predict the dantrolene binding pose, the putative dantrolene binding site was searched using three different docking programs; Vina, LeDock and Glide. There was a distinct difference around the dantrolene binding site between the AF2-based model and Cryo-EM based model. Thus, the docking was performed for either structure. The dantrolene population was obtained predominantly in a particular cavity formed by 6 domains. Among docking results, five binding poses (3 of cryo-em, 2 for AF2 model) were selected regarding the affinity scores and pose similarity. These poses were used in 200ns MD simulation (298K, NPT) to address the pose binding behaviour. In the simulations truncated system was used, and restraints were introduced at regions where we split the structure. After 200ns, four orientations of dantrolene (2 for each) remained in its interaction with the dantrolene binding sequence. To calculate the binding free energy of the binding poses, MMPBSA analysis was performed using MD trajectories. Besides this, we also investigated the FKBP12.6 binding effect on dantrolene binding using the docking structures. Here, all proceeded MD runs with dantrolene were replicated with FKBP12.6 bound conditions. Structural clustering of MD simulations together with MMPBSA results showed that particular dantrolene orientation showed the highest binding capability to around R606, E1649, and L1650 residues. However, we could not identify a significant effect of FKBP12.6 on dantrolene binding. Next, for the identification of novel inhibitors, we focused on the dantrolene binding region and the high-throughput screening of 3.5 million molecules retrieved from the ZINC15 database was applied. The molecules were selected based on molecular weights (%70 human oral absorption conditions, the best 11 molecules have proceeded for MD simulations. 200ns MD simulation was carried out using Desmond. The seven molecules remained in their interaction with the dantrolene binding sequence. These were suggested as candidates that might regulate RyR2 activity. Particularly, two molecules showed significant stability at the binding site at around 1Å. These molecules will be tested experimentally by our experimental collaborators.
Benzer Tezler
- Neisseria gonorrhoeae 1-deoksi-d-ksilüloz 5-fosfat redüktoizomeraz'ı hedef alan yeni inhibitörlerin hesaplamalı kimya yöntemleriyle tanımlanması
Identification of novel inhibitors targeting 1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate reductoisomerase in Neisseria gonorrhoeae with computational chemistry methods
MUSTAFA NECATİ HAŞİMOĞLU
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
BiyomühendislikYıldız Teknik ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. DİLEK BALIK
DOÇ. DR. ÖZAL MUTLU
- 3D modeling of malarial and neosporosis otu deubiquitinases and identification of novel otu inhibitors for therapy
Sıtma ve neosporoz OTU deübikitinazların 3B modellenmesi ve tedavi için Yeni OTU inhibitörlerinin tespit edilmesi
PINAR SİYAH
Doktora
İngilizce
2020
BiyomühendislikYeditepe ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. FATİH KOCABAŞ
- Identification of novel PARP1 inhibitors based on structural similarities of FDA approved drugs
FDA onaylı ilaçların yapısal benzerliklerine dayalı yeni PARP1 inhibitörlerinin tanımlanması
HANEEN AMMURI
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
BiyomühendislikBahçeşehir ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. SERDAR DURDAĞI
- Identification of novel small molecules targeting aurora B kinase
Aurora B kinazı hedef alan özgün küçük molekül inhibitorlerin saptanması
ESRA ÜNSAL
Yüksek Lisans
İngilizce
2015
BiyolojiKoç ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. NURHAN ÖZLÜ
- Applications of molecular modelling approaches for the identification of novel SARS-COV-2 RdRp inhibitors
Yeni SARS-COV-2 RdRp inhibitörlerinin tanımlanması için moleküler modelleme yaklaşımlarının uygulamaları
NTSOAKI BAITHEDI MOTAPANYANE
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
BiyofizikBahçeşehir ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. SERDAR DURDAĞI
YRD. DOÇ. DR. BERNA DOĞAN